Pojdite na zgornji link in počekirajte pod “ogled vestnika”. Odprla se vam bodo letna kazala (za leto 2001, 2002, 2003) in sedaj vas čaka veliko dela. Vsa 3 letna kazala počekirajte in našle boste tistih 5 ali 6 tem, ki se tičejo IVF-ja in neplodnosti. NImam pa pojma, zakaj moje zgornje povezave ne delujejo.

Zgornji linki pišejo o:
– pomenu opazovanja sluznice z UZ in njen vpliv na vgnezditev zarodka,
– vrstah stimulacij, ki se uporabljajo na GK LJ in v MB,
– IUI,
– kako izbrati najboljši spermij za icsi metodo (da je uspešna),
– tem, kakšni so uspehi in možnosti predčasne punkcije in dozorevanja jajčne celice v gojiščih (to delajo v MB)……………

Pišem na hitro zato ne vem, če sem pravilno vse napisala. Boste same presodile in prebrale. Se splača.

Citiraj

Odgovori

Taja 14.05.2003 ob 20:45 zadnji odgovor 10.02.2024 ob 18:30

Aja, pa še to! Avtorji so znani spec. za neplodnost z GK LJ in MB.

Citiraj

Odgovori

Nataša-H 14.05.2003 ob 21:47 zadnji odgovor 10.02.2024 ob 18:30

Punce – tole na tiskalnik, pa na dopust!!!!!

Nataša
________________________________________________________________

SPODBUJANJE OVULACIJE V POSTOPKU IVF-ET
Pregledni prispevek

——————————————————————————–
Robert Medved1, Sara Korošec1, Irena Virant2, Helena Meden-Vrtovec1
1 Klinični oddelek za reprodukcijo, Ginekološka klinika, Klinični center, Šlajmerjeva 3, 1525 Ljubljana
2 Bolnišnica za ginekologijo in porodništvo Kranj, Kidričeva 38a, 4000 Kranj

Prispelo 2001-09-25, sprejeto 2001-11-08; ZDRAV VESTN 2002; 71: 177-80
Ključne besede: spodbujanje ovulacije; IVF-ET; gonadotropini; agonisti GnRH; antagonisti GnRH

Izvleček – Izhodišča. Iz spoznanja, da je uspešnost postopka IVF-ET odvisna od števila prenesenih zarodkov, so se uveljavile različne metode spodbujanja ovulacije, ki omogočajo razvoj večjega števila ovarijskih foliklov, iz katerih pridobimo večje število jajčnih celic. V postopku IVF-ET uporabljamo več različnih načinov spodbujanja ovulacije: z gonadotropini, s kombinacijo gonadotropinov in agonistov GnRH ter s kombinacijo gonadotropinov in antagonistov GnRH. Uporaba samih gonadotropinskih preparatov za spodbujanje ovulacije v postopku zunajtelesne oploditve se vse bolj opušča. V večini ustanov, ki se ukvarjajo z zdravljenjem neplodnosti in postopkom zunajtelesne oploditve, sedaj uporabljajo predvsem kombinacijo agonistov GnRH z gonadotropini. Uporaba antagonistov GnRH je zaenkrat še v fazi uvajanja v redno klinično prakso.

Zaključki. Na Ginekološki kliniki v Ljubljani smo ob koncu leta 2000 prenehali s spodbujanjem ovulacije samo z gonadotropini in pri vseh bolnicah, ki se zdravijo pri nas s postopkom IVF-ET, spodbujamo ovulacijo s kombinacijo gonadotropinov in agonistov GnRH zaradi boljših rezultatov IVF-ET postopkov pri bolnicah, zdravljenih na ta način. Klinično raziskovalno delo na področju uporabe antagonistov GnRH pa bo pokazalo na možnosti uvedbe antagonistov GnRH v klinično prakso.

Uvod

Po rojstvu Luise Brown julija 1978, prvega otroka, spočetega zunaj materinega telesa, predstavlja postopek zunajtelesne oploditve (IVF – in vitro fertilization) in prenosa zarodkov v maternico (ET – embrio transfer) najprimernejšo metodo za zdravljenje neplodnosti pri parih, pri katerih so bili vsi drugi postopki zdravljenja neuspešni. Zdravljenje neplodnosti s postopkom IVF-ET na Kliničnem oddelku za reprodukcijo Ginekološke klinike Kliničnega centra v Ljubljani se je pričelo v letu 1983. Sprva je bila edina indikacija za uvedbo tovrstnega načina zdravljenja okvarjenost ali odsotnost jajcevodov, kmalu so se pridružile še moška neplodnost, endometrioza, imunološki vzrok in idiopatska neplodnost (1).
Vsak mesec pri zdravi ženski v rodnem obdobju dozori in se sprosti le ena jajčna celica. V razvojni fazi so postopki IVF-ET potekali v spontanem ciklusu, pri čemer je bilo mogoče iz jajčnikov aspirirati le po eno jajčno celico. Iz spoznanja, da je uspešnost postopka IVF-ET odvisna od števila prenesenih zarodkov, so se uveljavile različne metode spodbujanja, ki hkrati omogočajo razvoj večjega števila ovarijskih foliklov, iz katerih pridobimo večje število jajčnih celic (1). Ker prenos večjega števila zarodkov pomeni tudi večjo možnost mnogoplodovne nosečnosti, prenašamo na Ginekološki kliniki v Ljubljani v maternico po dva zarodka hkrati, nadštevilne zarodke pa od leta 1995 z zamrzovanjem shranimo za poznejše ET postopke (2).

Spodbujanje ovulacije v postopku IVF-ET

V postopku IVF-ET uporabljamo več različnih načinov spodbujanja ovulacije:

– spodbujanje ovulacije z gonadotropini,
– spodbujanje ovulacije s kombinacijo gonadotropinov in agonistov gonadotropin sproščujočega hormona (GnRH),
– spodbujanje ovulacije s kombinacijo gonadotropinov in antagonistov GnRH.

Spodbujanje ovulacije z gonadotropini

Gonadotropini [humani menopavzni gonadotropini (HMG): PergonalR – Serono, HumegonR – Organon in humani horionski gonadotropini (HCG): PrimogonylR – Organon, ProfasiR – Serono] se uspešno uporabljajo za indukcijo ovulacije pri pomanjkanju gonadotropinov (1) ter pri nadzorovani hiperstimulaciji ovarijev.
Kot vir folikel spodbujajočega hormona (FSH) se uporabljajo HMG, vendar imajo nizko specifično aktivnost in vsebujejo tudi luteinizirajoči hormon (LH) in druge proteine, kar je verjetno vzrok za slabšo kakovost jajčnih celic, manjšo stopnjo oploditve, slabšo vgnezditveno sposobnost zarodkov in večjo stopnjo zgodnjih spontanih splavov (3-6).
Boljše klinične rezultate dajejo visoko prečiščeni preparati FSH, pridobljenega iz urina postmenopavznih žensk (urofollitropin in visoko prečiščeni urofollitropin), ki vsebujejo značilno manj LH (6-8). V 90. letih so razvili dva rekombinantna humana FSH preparata (rFSH: follitropin a in follitropin b) (9, 10), ki ne vsebujeta LH aktivne komponente ali drugih humanih proteinov. Ta tehnologija ima prednost v tem, da proizvodnja FSH ni odvisna od zbiranja urina in da je zagotovljena konstantna vsebnost FSH. Zaradi visoke čistosti je rFSH zelo varen in ga ženske zelo dobro prenašajo (11, 12).
Gonadotropini se uporabljajo v različnih protokolih, ki se razlikujejo predvsem po dnevnih odmerkih ter po indikacijah za dodatek HCG. Z dodajanjem gonadotropinov pričnemo 2. ali 3. dan ciklusa, če v ovarijih ni cist ali večjih foliklov (13). Začetni odmerki gonadotropinov so nekoliko večji, nato odmerek individualno zmanjšamo glede na odzivnost jajčnikov, ocenjeno s povečanjem koncentracije serumskega estradiola in rastjo ovarijskih foliklov. Rast foliklov spremljamo z UZ merjenjem od 7. do 8. dneva ciklusa naprej ter z določanjem serumskega estradiola. Ko dosežemo uspešno stimulacijo (navzočnost vsaj dveh foliklov, velikih od 15 do 18 mm in primerno zvečanje koncentracije E2) (1), dodamo HCG v odmerku 10.000 IE za dozorenje oocitov. Vsrkanje oocitov opravimo 34-36 ur po dodajanju HCG.
V postopkih IVF-ET, pri katerih za spodbujanje rasti ovarijskih foliklov uporabljamo gonadotropine, se sporadično pojavlja prezgodnji endogeni porast LH, ki ga povzroči endogeni GnRH (14). Glavni vzrok za klinične neuspehe je prezgodnji vrh LH, ki se pojavlja pri približno 15% spodbujanih ciklusov (15, 16), verjetno kot odgovor na večje koncentracije estradiola.
V svetu se opisani protokol spodbujanja jajčnikov v postopku IVF-ET skoraj ne uporablja več. V zadnjih letih vse raziskave s tega področja temeljijo na protokolih, pri katerih uporabljajo enega od več načinov desenzibilizacije hipofize, s čimer se prepreči endogeni porast LH. Rezultati tako spodbujenih ciklusov so boljši: več je pridobljenih oocitov, oociti so boljše kakovosti, večja je stopnja oploditve in nosečnosti (17-19).

Spodbujanje ovulacije s kombinacijo gonadotropinov in agonistov GnRH

Pri zorenju foliklov v jajčniku prihaja v naravnih pogojih do povečanega izločanja estradiola, kar povzroči porast luteinizirajočega hormona (LH), ta pa ovulacijo in luteinizacijo folikla. Pri spodbujanju ovulacije pride do istočasnega zorenja večjega števila jajčnih foliklov v jajčniku. Ob tem se izloča več estradiola v času, ko jajčne celice še niso dozorele. Posledično nastopi prezgodnji porast LH in prezgodnja luteinizacija foliklov z nezrelimi jajčnimi celicami ali prezgodnja ovulacija, kar je najpogostejši vzrok za neuspeh postopka (20, 21). Z uporabo agonistov GnRH lahko preprečimo prezgodnji porast LH in hkrati natančno določimo čas dozorevanja celic.
Uporaba agonistov GnRH povzroči zvečano sproščanje gonadotropinov (LH in FSH) iz hipofize ter indukcijo receptorjev GnRH na membranah hipofiznih celic. V 12 urah pride do petkratnega porasta ravni FSH, desetkratnega porasta ravni LH in štirikratnega porasta ravni estradiola v krvi (22). Nadaljevanje dodajanja agonistov GnRH povzroči nasprotni učinek, pride do zaviranja sinteze gonadotropinov in zmanjšanja števila receptorjev GnRH. Približno po štirinajstih dneh uporabe agonistov GnRH hipofiza preneha s sintezo in sproščanjem gonadotropinov (medikamentozna hipofizektomija), kar se klinično izraža z nizko ravnjo estradiola v serumu in odsotnostjo jajčnih foliklov pri ultrazvočnem pregledu (20, 23). Ob takšnem stanju ovarijev ravni LH in FSH uravnavamo z zunanjim dodajanjem obeh hormonov. Zavora delovanja hipofize traja, dokler bolnica prejema terapijo z agonisti GnRH in je popolnoma reverzibilna. Menstruacijski ciklus se (če ne pride do nosečnosti) praviloma vzpostavi v šestih tednih (23).
Za uspeh zdravljenja s postopkom IVF-ET so ob drugih dejavnikih (stopnja zrelosti endometrija, receptivnost endometrija) zelo pomembne kakovostne jajčne celice, ki jih dobimo z učinkovitim spodbujanjem jajčnikov. Zavora delovanja hipofize z agonisti GnRH omogoča natančno časovno usklajenost dozorevanja in vsrkavanja jajčnih celic, kar posledično vpliva na to, da je delež ciklusov, ki jih je treba prekiniti, bistveno manjši (24-26). Prednosti uporabe agonistov GnRH prikazuje razpredelnica 1.

Razpr. 1. Prednosti spodbujanja ovulacije v postopku zunajtelesne oploditve z uporabo agonistov GnRH in gonadotropinov v primerjavi z uporabo samih gonadotropinov (24, 27-32).

Natančna časovna usklajenost dozorevanja in izsrkavanja jajčnih celic
Precise synchronization of oocyte maturation and aspiration

Večje število izsrkanih jajčnih celic
Higher number of aspirated oocytes

Manjše tveganje za prezgodnjo luteinizacijo foliklov
Lower risk of premature luteinization

Večji delež oploditve jajčnih celic
Higher fertilization rate

Večji delež vgnezditve zarodka
Higher implantation rate

Večji delež nosečnosti
Higher pregnancy rate

Od prvih opisov rezultatov uporabe agonistov GnRH pred 16 leti (33) se je omenjeni način spodbujanja ovulacije izredno uveljavil. Mnogi centri, kjer zdravijo neplodnost s postopkom zunajtelesne oploditve, ga že dlje časa uporabljajo kot vodilni, če ne edini način spodbujanja ovulacije (24, 25).
Z uporabo omenjenih zdravil se je delež nosečnosti v IVF-ET postopkih zelo povečal (28, 34).
Uporaba agonistov GnRH se je izkazala za uspešno tudi pri bolnicah s policističnimi jajčniki (PCO) (35, 36). Ob zaviranju prezgodnje luteinizacije foliklov je uporaba teh zdravil zvišala delež nosečnosti in znižala delež spontanih splavov (37). Kot uspešni so se preparati agonistov GnRH izkazali tudi pri bolnicah z endometriozo in miomi maternice (34).
Med agonisti GnRH se najpogosteje uporabljajo buserelin acetat (SuprefactR – Hoechst) v intramuskularni, subkutani ali intranazalni obliki. Goserelin (ZoladexR – Zeneca) in triptorelin (DecapeptylR – Ipsen Biotech) se uporabljata subkutano v depojski obliki z delovanjem enega do treh mesecev. Protokoli uporabe so različni: dolgi, kratki in ultrakratki. Za najuspešnejšega v IVF postopku se je izkazal dolgi protokol (38).

Spodbujanje ovulacije s kombinacijo gonadotropinov in antagonistov GnRH

Antagonisti GnRH so kompetitivni blokatorji receptorjev GnRH hipofize. Z vezavo na receptor preprečijo spodbujajoč učinek endogenega GnRH in s tem povzročijo hipofizno desenzibilizacijo, kar ima za posledico naglo znižanje serumske koncentracije LH in FSH, brez začetnega učinka “flare-up”, ki ga povzročajo agonisti GnRH. Zato antagoniste GnRH pri postopku zunajtelesne oploditve apliciramo le med spodbujanjem ovulacije z gonadotropini, in še to le tiste dni, ko obstaja možnost prezgodnjega vrha LH. Sproščanje telesu lastnih gonadotropinov ostane v začetku ciklusa nemoteno, zato je potreba po gonadotropinih pri uporabi antagonistov GnRH nižja kot pri uporabi agonistov GnRH, kjer hipofizo popolnoma zavremo že pred pričetkom spodbujanja s hMG. Postopek je povsem povraten in po prenehanju prejemanja antagonistov GnRH se delovanje hipofize v popolnosti povrne (39). Leta 1999 sta prišla na tržišče prva predstavnika antagonistov GnRH, ki ne povzročata sproščanja histamina in sta zato primerna za klinično uporabo. To sta cetrorelix (CetrotideR, Asta Medica, Nemčija) in ganirelix (OrgalutranR, Organon, Nizozemska) (40).
Poznana sta dva načina uporabe antagonistov GnRH v kombinaciji z gonadotropini za spodbujanje ovulacije v postopku IVF-ET: protokol z več odmerki, pri katerem dajemo po 0,25 mg antagonista GnRH od petega dne spodbujanja ovulacije do aplikacije hCG, in protokol z enim odmerkom, pri katerem apliciramo 3 mg antagonista GnRH sedmi dan spodbujanja ovulacije (41).
Od registracije aprila 1999 je bil cetrorelix uporabljen že v več kot 17.000 postopkih zunajtelesne oploditve (42). Dosedanje raziskave uporabe antagonistov GnRH v kombinaciji z gonadotropini pri spodbujanja ovulacije v postopku zunajtelesne oploditve (42-49) so pokazale:
– da je uporaba antagonistov GnRH pri spodbujanju ovulacije v postopku IVF učinkovita in enostavna,
– da se stopnji oploditve in nosečnosti med protokoloma z agonisti GnRH in z antagonisti GnRH bistveno ne razlikujeta,
– da ima protokol z antagonisti GnRH nekatere prednosti pred protokolom z agonisti GnRH, in sicer:
– bistveno krajši postopek (namesto 14-dnevne aplikacije agonistov GnRH prejme bolnica le eno aplikacijo antagonista GnRH),
– nižji stroški zdravljenja zaradi manjše porabe gonadotropinov,
– izognitev učinku “flare-up” agonistov GnRH,
– manjša pojavnost sindroma ovarijske hiperstimulacije.
Na Ginekološki kliniki v Ljubljani poteka prospektivna, primerjalna raziskava, v kateri primerjamo klinično učinkovitost antagonistov GnRH z agonisti GnRH v postopku zunajtelesne oploditve. Za spodbujanje ovulacije z gonadotropini in antagonisti GnRH uporabljamo protokol z enim odmerkom antagonista GnRH. Doslej smo z uporabo antagonistov GnRH opravili 35 postopkov zunajtelesne oploditve. Na temelju preliminarnih rezultatov naše raziskave sklepamo, da je uporaba antagonistov GnRH v kombinaciji z gonadotropini varen, učinkovit in enostaven način spodbujanja ovulacije v postopku zunajtelesne oploditve (50).

Razpr. 2. Uporaba samih gonadotropinov in kombinacije gonadotropinov z agonisti GnRH za spodbujanje ovulacije v postopku zunajtelesne oploditve v Franciji v letih 1987 do 1998 (51, 52).

Leto
Year 1987 1988 1989 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998
Gonadotropini (%)
Gonadotropins (%) 39,8 11,1 12 10 9,3 8,7 10,3 10,1 9,2 8,1 4,4 4,1

Gonadotropini in
agonisti GnRH (%)
Gonadotropins + 60,2 88,9 88 90 90,7 91,3 89,7 89,9 90,8 91,9 95,6 95,9
GnRH agonists (%)

GnRH – Gonadotropin sproščujoči hormon / Gonadotropin-releasing hormone

Razpravljanje

Zaradi že omenjenih prednosti uporabe agonistov GnRH v kombinaciji z gonadotropini se uporaba samih gonadotropinskih preparatov za spodbujanje ovulacije v postopku zunajtelesne oploditve v svetu opušča. Po podatkih iz literature (17-19, 24, 25, 34) v večini ustanov, ki se ukvarjajo z zdravljenjem neplodnosti in postopkom zunajtelesne oploditve, sedaj za spodbujanje ovulacije uporabljajo predvsem kombinacijo agonistov GnRH z gonadotropini. V razpredelnici 2 so prikazani odstotki uporabe samih gonadotropinov in kombinacije gonadotropinov z agonisti GnRH za spodbujanje ovulacije v postopku zunajtelesne oploditve v Franciji v letih 1987 do 1998. Iz razpredelnice je jasno vidno, kako se je odstotek spodbujanja ovulacije samo z gonadotropini znižal iz 39,8% leta 1987 na komaj 4,1% leta 1998.
Uporaba antagonistov GnRH pri spodbujanju ovulacije v postopku zunajtelesne oploditve je zaenkrat še v fazi uvajanja v redno klinično prakso. Prvi rezultati njihove uporabe so spodbudni, vendar je še vedno prezgodaj za napovedi, ali bodo v prihodnosti antagonisti GnRH pri spodbujanju ovulacije nadomestili agoniste GnRH.

Zaključki

Na osnovi naših lastnih izkušenj uporabe samih gonadotropinov in ker se uporaba samo teh za spodbujanje ovulacije v postopku zunajtelesne oploditve v svetu opušča, smo tudi na Ginekološki kliniki v Ljubljani ob koncu leta 2000 prenehali s spodbujanjem ovulacije samo z gonadotropini in prešli pri vseh bolnicah, ki se pri nas zdravijo s postopkom IVF-ET, na spodbujanje ovulacije s kombinacijo gonadotropinov in agonistov GnRH. Ta ukrep smo uvedli predvsem zaradi boljših rezultatov IVF-ET postopkov pri bolnicah, zdravljenih na ta način. Če se bodo antagonisti GnRH izkazali kot dovolj učinkoviti, jih bomo uvedli v redno klinično prakso.

Literatura

1. Meden-Vrtovec H, Hren-Vencelj H. Zunajtelesna oploditev. In: Meden-Vrtovec H ed. Neplodnost. Ljubljana: Cankarjeva založba, 1989: 343-62.
2. Virant-Klun I, Veble A, Valenčič B et al. Zamrzovanje in odmrzovanje zarodkov v programu zunajtelesne oploditve. Zdrav Vestn 1998; 67: 495-9.
3. Stanger JD, Yovich JL. Reduced in vitro fertilization of human oocytes from patients with raised basal luteinizing hormone levels during the follicular phase. Br J Obstet Gynaecol 1985; 92: 385-92.
4. Homburg R, Armar NA, Eshel A et al. Influence of serum luteinizing hormone concentrations on ovulation, conception and early pregnancy loss in polycystic ovarian syndrome. Br Med J 1988; 297: 1024-6.
5. Punnonen R, Ashorn R, Vilja P et al. Spontaneous luteinizing hormone surge and cleavage of in vitro fertilized embryos. Fertil Steril 1988; 49: 479-82.
6. Daya S, Gunby J, Hughes EG et al. Follicle-stimulating hormone versus human menopausal gonadotrophin for in vitro fertilization cycles: a meta-analysis. Fertil Steril 1995; 64: 77-86.
7. Howles CM, Loumaye E, Giroud D, Luyed G. Multiple follicular development and ovarian steroidogenesis following subcutaneous administration of a highly purified urinary FSH preparation (Metrodin High Purity) in pituitary desensitized women undergoing IVF-ET: a multicentre European Phase III study. Hum Reprod 1994; 9: 424-30.
8. Wikland M, Borg J, Hamberger L, Sulander P. Simplification of IVF, minimal monitoring and the use of subcutaneous highly purified FSH administration of ovulation induction. Hum Reprod 1994; 9: 1430-6.
9. Chappel S, Kelton C, Nugent N. Expression of human gonadotropins by recombinant DNA methods. In: Genazzani AR, Petraglia F eds. Proceedings of the 3rd World Congress on Gynaecological Endocrinology. Carnforth: Parthenon Publishing Group, 1992: 179-84.
10. Olijve W, De Boer W, Mulders JWM et al. Molecular biology and biochemistry of human recombinant follicle stimulating hormone (Puregon). Mol Hum Reprod 1996; 2: 371-82.
11. Luomaye E, Campbell R, Salat-Baroux J. Human-follicle-stimulating hormone produced by recombinant DNA technology: a review for clinicians. Hum Reprod Update 1995; 1: 188-99.
12. Rekombinant Human FSH Product Development Group. Recombinant follicle stimulating hormone: development of the first biotechnology product of the treatment of infertility. Hum Reprod Update 1998; 4: 862-81.
13. Raphael RE. Gonadotropins and combined gonadotropin-releasing hormone agonist-gonadotropins protocols in a randomized prospective study. Fertil Steril 1991; 55: 574-8.
14. Letterie GS. Inhibition of gonadotropin surge by a brief mid-cycle regimen of adhinyl estradiol and noredhindrone: possible rule in in vitro fertilization. Gynaecol Endocrinol 2000; 14: 1-4.
15. Strowitzki T, Kentenich H, Kiesel L, Neulen J, Bilger W. Ovarian stimulation in women undergoing in-vitro fertilization and embryo transfer using recombinant human follicle stimulating hormone (Gonal-F) in non-down-regulated cycles. Hum Reprod 1995; 10: 3097-101.
16. Cees AM, Jansen et al. A prospective randomized clinical trial comparing recombinant follicle stimulating hormone (Puregon) and human menopausal gonadotrophins (Humegon) in non-down regulated in vitro fertilization patients. Hum Reprod 1998; 13: 2995-9.
17. Smitz J, Devroey P et al. Management of failed cycles in an IVF-GIFT programme with the combination of a GnRH analogue and hMG. Hum Reprod 1987; 2: 309-14.
18. Loumaye E. The control of endogenous secretion of LH by gonadotrophin-releasing hormone agonist during ovarian hyperstimulation for in-vitro fertilization and embryo transfer. Hum Reprod 1990; 5: 357-76.
19. Houghes EG, Fedorkow DM, Daya S et al. The routine use gonadotrophine-releasing hormone agonist prior to in vitro fertilization and gamete intrafallopian transfer: a meta-analysis of randomized controlled trials. Fertil Steril 1992; 58: 888-96.
20. Meden-Vrtovec H. Indukcija ovulacije. In: Prelevič GM ed. Klinička reproduktivna endokrinologija. 3th ed. Beograd: Nauka, 1996: 409-28.
21. Olivennes F, Fanchin R, Bouchard P et al. The single or dual administration of the gonadotropin-releasing hormone antagonist Cetrorelix in an in vitro fertilization-embryo transfer program. Fertil Steril 1994; 62: 468-76.
22. Lemay A, Maheux R, Faure N et al. Reversible hipogonadism induced by a luteinising hormone releasing hormone (LH-RH) agonist (buserelin) as a new therapeutic approach for entometriosis. Fertil Steril 1984; 41: 863-71.
23. Reissman T, Felberbaum R, Diedrich K et al. Development and applications of luteinising hormone releasing hormone antagonists in the treatment of infertility: an overview. Hum Reprod 1995; 10: 1974-81.
24. Diedrich K, Felderbaum R. New approaches to ovarian stimulation. Hum Reprod 1998; 13: Suppl 3: 1-13.
25. Tan SL, Kingsland C, Campbell S et al. The long protocole of administration of gonadotrophin-releasing hormone agonist is superior to the short protocole for ovarian stimulation for in vitro fertilization. Fertil Steril 1992; 57: 810-4.
26. Tapanainen J, Hovatta O, Juntunen K et al. Subcutaneous goserelin versus intranasal buserelin for pituitary down-regulation in patients undergoing IVF: A randomized comparative study. Hum Reprod 1993; 8: 2052-5.
27. FIVNAT 1995 French in-vitro national evaluation. Contracept Fertil Sex 1996; 24: 694-9.
28. Hughes E, Fedorkow D, Daya S et al. The routine use of GnRHa prior to IVF and GIFT, a meta-analysis of randomized controlled trials. Fertil Steril 1992; 58: 888-96.
29. Maroulis G, Emery M, Verkauf B et al. Prospective randomized study of human menotropine versus follicular and luteal phase GnRHa/human menotropine stimulation pretocols for IVF. Fertil Steril 1991; 55: 1126-31.
30. Rutheford A, Subak-Sharp R, Daffson K et al. Improvement of IVF after treatment with buserelin, an agonist of LHRH. Br Med J 1988; 296: 1765-8.
31. Testard J, Forman J, Belaisch-Allart J et al. Embryo quality and uterine receptivity in IVF cycles with or without GnRHa. Hum Reprod 1989; 4:
198-201.
32. Elgendy M, Afnan M, Holder R et al. Reducing the dose of gonadotropin releasing hormone agonist on starting ovarian stimulation: effect on ovarian response and IVF outcome. Hum Reprod 1998; 13: 2382-5.
33. Porter RN, Smith V, Craft IL et al. Induction of ovulation for in vitro fertilization using buserelin and gonadotropins. Lancet 1984; 2: 1284-5.
34. Akagbosu FT. The use of GnRH agonist and antagonists in infertility. In: Brinsden PR ed. In vitro fertilization and assisted reproduction. 1th ed. New York: The Parthenon Publishing Group, 1999: 83-9.
35. Filicori M. Polycystic ovary syndrome: abnormalities and management with pulsatile gonadotrophin-releasing hormone and gonadotrophin-releasing hormone analogs. Am J Obstet Gynecol 1990; 163: 1737-42.
36. Lamberc SWJ, Timmers JM, Osterom R et al. Testosterone secretion by cultured Arrphenoblastoma cells: Suppression by luteinising hormone agonist. J Clin Endocrinol Metab 1982; 54: 450-0.
37. Damario MA, Barmat L, Liu CH, Davis OK et al. Dual suppression with oral contraceptives and gonadotropin releasing hormone agonists improves in-vitro fertilization outcome in high responder patients. Hum Reprod 1997; 12: 2359-65.
38. Smitz J, Ron-El R, Tarlatzis BC. The use of gonadotrophin-releasing hormone agonists for in vitro fertilization and other assisted procreation techniques: experience from three centres. Hum Reprod 1992; 7: Suppl 1: 49-66.
39. Asta Medica. Cetrorelix, a new millennium in the treatment with IVF. File. Diemen: Asta Medica, 1999.
40. Bouchard P, Fauser BCJM. Gonadotropin-releasing hormone antagonist: new tools vs. old habits. Fertil Steril 2000; 73: 18-20.
41. Asta Medica. CetrotideR. Product Monograph. Asta Medica, 1999.
42. Diedrich K. World-wide experience with CetrotideR in the multiple dosing regimen. In: Ferti Magazine, Special ESHRE 2000 Reports.
http://www.ferti.net/med/fertimagazine/congressreport/eshre2000-24.asp
43. Olivennes F, Belaisch-Allart J, Emperaire JC et al. Prospective, randomized, controlled study of in vitro fertilisation-embryo transfer with a single dose of a luteinizing hormone-releasing hormone (LH-RH) antagonist (cetrorelix) or a depot formula of an LH-RH agonist (triptorelin). Fertil Steril 2000; 73: 314-20.
44. Albano C, Felberbaum RE, Smitz J et al. Ovarian stimulation with HMG: results of a prospective randomised phase III European study comparing the luteinizing hormone-releasing hormone (LHRH)-antagonist cetrorelix and the LHRH-agonist buserelin. Hum Reprod 2000; 15: 526-31.
45. The European OrgalutranR Study Group, Borm G, Mannaerts B. Treatment with the gonadotrophin-releasing hormone antagonist ganirelix in women undergoing ovarian stimulation with recombinant follicle stimulating hormone is effective, safe and convenient: results of a controlled, randomized, multicentre trial. Hum Reprod 2000; 15: 1490-8.
46. Diedrich K, Felberbaum R. LHRH-antagonists: Where are the advantages in ART? In: Cetrotide. A new concept is born in the control of ovarian stimulation. Tours: ESHRE ’99, ASTA Medica Symposium, 1999: 2-5.
47. Olivennes F, Fanchin R, Rongieres-Bertrand C, Bouchard P, Frydman R. LHRH-antagonist (Cetrorelix) in single dose applications. In: Cetrotide. A new concept is born in the control of ovarian stimulation. ASTA Medica Symposium. Tours: ESHRE ’99, 1999: 6-7.
48. Riethmller-Winzen H, Prothmann A, Peukert M, Engel J. CetrotideR (Cetrorelix) pregnancy rates and safety aspects. In: Cetrotide. A new concept is born in the control of ovarian stimulation. ASTA Medica Symposium. Tours: ESHRE ’99, 1999: 8-9.
49. De Jong D, Macklon NS, Mannaerts BMJL, Coelingh Bennink HJT, Fauser BCJM. High dose gonadotrophin-releasing hormone antagonist (ganirelix) may prevent ovarian hyperstimulation syndrome caused by ovarian stimulation for in-vitro fertilisation. Hum Reprod 1998; 13: 573-5.
50. Medved R, Meden-Vrtovec H. Primerjava uporabe GnRH antagonistov in GnRH agonistov v postopku zunajtelesne oploditve – preliminarni rezultati. In: Kralj B, Denona V eds. Zbornik 2. kongresa ginekologov in porodničarjev Slovenije z mednarodno udeležbo; 2000, Nov. 19-22; Portorož, Slovenija. Ljubljana: Združenje ginekologov in porodničarjev Slovenije; 2000: 236-6.
51. Dossier FIVNAT 96. French National Registry 1996.
52. Dossier FIVNAT 99. French National Registry 1999.

________________________________________________________________

VPLIV IZBIRE ZARODKOV, SPOČETIH Z VNOSOM SEMENČICE V CITOPLAZMO JAJČNE CELICE, NA VGNEZDITEV ZARODKOV PO PRENOSU V MATERNICO
Strokovni prispevek

——————————————————————————–

Veljko Vlaisavljević, Borut Kovačič, Vida Gavrić-Lovrec, Milan Reljič, Vidka Petrovič, Mojca Čižek-Sajko, Vilma Kovač
Oddelek za reproduktivno medicino in ginekološko endokrinologijo, Služba za ginekologijo in perinatologijo, Splošna bolnišnica, Ljubljanska 5, 2000 Maribor

Prispelo 2001-09-03, sprejeto 2001-12-03; ZDRAV VESTN 2002; 71: Supl. I: 7-11
Ključne besede: kakovost zarodkov; število zarodkov; prenos zarodkov; blastociste; zanositev

Izvleček – Izhodišča. Namen raziskave je bil analizirati rezultate postopka ICSI glede števila in kakovosti zarodkov, ki smo jih prenesli v maternico tri ali pet dni po oploditvi.

Metode. Analizirali smo izid prenosa 1498 zarodkov tretji dan po oploditvi in prenosa 364 pet dni starih zarodkov (blastocist). Primerjali smo delež vgnezdenih zarodkov glede na trajanje inkubacije, število in kakovost prenesenih zarodkov. Razlike v stopnji zanositve med posameznimi skupinami smo ugotavljali s testom hi-kvadrat.

Rezultati. Vgnezdilo se je 21,3% (320/1498) zarodkov, ki smo jih prenesli v maternico 3 dni po oploditvi. Ob prenosu enega, dveh, treh ali štirih zarodkov se je stopnja zanositev povečevala od 20,0%, 22,1%, 54,5% na 59,0%. V skupini z enim ali dvema zarodkoma za prenos se stopnja zanositve v odvisnosti od kakovosti zarodkov ni spreminjala statistično značilno. Prenos vsaj enega zarodka dobre kakovosti med tremi ali štirimi prenesenimi zarodki je statistično pomembno vplival na stopnjo enoplodne zanositve (37,8% oz. 41,3%). Stopnja večplodnih nosečnosti je ostala nizka (18,1% oz. 16,6%). Stopnja dvoplodnih zanositev ob prenosu dveh zarodkov dobre kakovosti je bila 66,6% (8/12). S povečevanjem deleža dobrih zarodkov za prenos na tri ali štiri se je povečeval delež zanositev (55,5% oz. 75,8%), še bolj pa odstotek večplodnih vgnezditev (43,1% oz. 54,5%). Po prenosu 5 dni starih zarodkov (blastocist) se je vgnezdilo 37,3% (136/364) zarodkov. Ob prenosu ene blastociste je bila stopnja zanositve 36,2% (21/58), ob prenosu dveh blastocist pa je zanosilo 55,7% (98/176) žensk. Delež dvoplodnih nosečnosti ob prenosu dveh blastocist je bil 38,7%.

Zaključki. Prenos zarodkov v stopnji blastociste statistično pomembno poveča uspešnost postopka zunajtelesne oploditve. S prenosom dveh blastocist ostane delež dvoplodnih zanositev enako visok kot po prenosu treh kakovostnih zarodkov tretji dan po oploditvi.

Uvod

Številne raziskave, ki razčlenjujejo razloge za različno uspešnost postopkov zunajtelesne oploditve, ugotavljajo odvisnost stopnje zanositve po prenosu zarodkov v maternico (ET – embryotransfer) od številnih dejavnikov. Najpogostejši med njimi so starost ženske, vzrok neplodnosti, način spodbujanja ovulacije oz. priprave za punkcijo ter pogoji kultiviranja jajčnih celic in zarodkov v laboratoriju za IVF (1). Pri postopku zunajtelesne oploditve z mehaničnim vnosom oziroma vbrizganjem semenčice v citoplazmo jajčne celice (ICSI) imamo pogosto opravka le z neplodnostjo moškega, ženska pa je zdrava. Pri tem na uspešnost postopka ne vplivajo število semenčic, morfološke značilnosti semenčice ali način njihove pridobitve (iz ejakuliranega semena ali iz bioptičnega materiala testisa) (2). Na rezultat postopka pomembno vpliva izkušenost laboratorija v tehniki ICSI (3-5).
V maternico prenesemo več zarodkov, ker v tem primeru pričakujemo večjo verjetnost, da se bo vsaj eden od njih vgnezdil. Zaradi nenehnega izboljševanja rezultatov zunajtelesne oploditve in globalnega naraščanja števila večplodnih nosečnosti po zdravljenju s tehnikami zunajtelesne oploditve so centri za zunajtelesno oploditev nenehno zmanjševali število prenesenih zarodkov ob ET. Vzrok je bilo veliko število nezaželenih večplodnih nosečnosti po prenosu večjega števila zarodkov (6, 7). Od prej splošno sprejetega načela o prenosu štirih zarodkov v prvi polovici 90. let priporočajo danes najpogosteje prenos le treh ali dveh zarodkov (8-10). Redki centri se odločajo za prenos le enega zarodka v maternico, in še to le v skupini z visokim tveganjem za nastanek večplodne nosečnosti (11). Prospektivne raziskave, ki bi potrdila enako uspešnost takšnega pristopa tudi pri neselekcionirani skupini žensk, še ni.
Ocenjevanje morfološke ustreznosti zarodka (“kakovosti zarodka”) je tako postalo izjemno pomemben del postopka, saj izbor najprimernejšega zarodka izmed mnogih neposredno vpliva na uspešnost postopka. Med postopkom zunajtelesne oploditve je mogoče opazovati izgled jajčne celice in razvoj zarodka v vseh fazah do prenosa v maternico. Na osnovi morfoloških meril, ki vključujejo oceno izgleda in hitrosti delitve blastomer ter prisotnost in delež delcev citoplazemskih
vključkov med blastomerami, lahko izbiramo med zarodki tiste z večjim potencialom za vgnezditev (12, 13). Zarodki, ki so po morfološkem izgledu slabše ocenjeni, tudi imajo možnost za vgnezditev, vendar se to zgodi redkeje kakor pri bolje ocenjenih zarodkih (14). To lastnost imajo tudi zarodki, nastali v in vivo pogojih, kar napeljuje na sklep, da je prisotnost zarodkov slabe kakovosti eden od načinov uravnavanja človekove sposobnosti za zanositev (15).
Podaljšan razvoj zarodkov v gojišču 5 dni po oploditvi, ko le-ti dosežejo stopnjo blastociste, omogoča izbiro najbolj vitalnih zarodkov. V maternico je zato možno prenesti manjše število zarodkov. Toda tudi v tem primeru se le redko odločajo za prenos enega samega zarodka pri vseh ženskah (16-18). Izjema so le postopki zunajtelesne oploditve v naravnem ciklusu, kjer običajno dozori le ena jajčna celica, na kateri opravimo postopek ICSI.
V naši raziskavi smo analizirali stopnjo implantacije po prenosu zarodkov v ciklih ICSI. Primerjali smo izide prenosa zarodkov drugi ali tretji dan po oploditvi z rezultati prenosa peti dan po oploditvi. Analizirali smo vpliv števila in kakovosti zarodkov na izid postopka ICSI. Uspešnost postopka smo ocenjevali s stopnjo zanositev na cikel s punkcijo foliklov ter s stopnjo zanositev na prenos zarodka.

Metode dela

Uspešnost postopka ICSI smo analizirali na neselekcionirani skupini žensk, ki so opravile postopek med 1. 1. 1995 in 31. 6. 2000. Vse so opravile postopek v ciklu ICSI, ki smo ga spodbujali z gonadotropini ali kombinacijo agonistov gonadotropin sproščajočega hormona in gonadotropini. Analizirali smo le cikle ICSI, pri katerih smo za vbrizganje uporabili semenčice, izolirane iz semenskega izliva. Oploditev z zamrznjenim semenom ali s semenčicami iz punktata testisa ali bioptičnega materiala testisa nismo zajeli v raziskavo.
O načinu vodenja ciklov med spodbujanjem ovulacije (19) in o laboratorijskem delu postopka (20) smo že poročali.
Jajčne celice smo po vnosu semenčice v citoplazmo gojili v kapljici enostavnega gojišča MediCult (Danska) v petrijevki, prekriti s parafinskim oljem. Oploditev (fertilizacijo) smo ocenjevali 16 do 18 ur po vbrizganju semenčice v jajčno celico. Za normalen izvid oploditve smo upoštevali le prisotnost dveh pronukleusov v citoplazmi jajčne celice. Jajčnih celic, pri katerih smo opazili razvoj le enega pronukleusa (partenogenetsko aktivirane jajčne celice), in tistih s tremi pronukleusi (diginične jajčne celice) nismo uporabili v kliničnem delu. Drugi dan po punkciji (dan +2) smo ocenili razvoj zarodkov. V primerih, ko smo za embriotransfer imeli na voljo več kot štiri zarodke, smo kultiviranje podaljšali še za en dan (dan +3) v gojišču M2 (MediCult, Danska). Do leta 1997 smo prenos zarodkov v maternico opravili dva dni po osemenitvi jajčne celice. V maternico smo prenesli največ po štiri zarodke. Po letu 1997 smo v maternico prenašali največ po tri zarodke. Od decembra 1999 smo prenos zarodkov opravili 5 dni po aspiriranju in v maternico prenašali enega ali le dva zarodka. Pri tem smo zarodke gojili v sekvencijskem gojišču BlastAsist (Medicult, Danska). Zarodke smo ocenjevali na invertnem mikroskopu Olympus, opremljenem s Hoffmanovo optiko, pri 200- in 400-kratni povečavi. Ocenjevali smo število in enakomernost blastomer ter prisotnost in količino citoplazmatskih vključkov brez jeder (fragmentov) med blastomerami. Vsak zarodek smo ocenili z oceno od 1 do 4 (1 – brez fragmentov, 2 – do 20% fragmentacij, 3 – med 20% in 50% fragmentacij, 4 – več kot 50% fragmentacij) in z “a” ali “b” enakomernosti blastomer. Kot dobre zarodke smo ocenili tiste, ki so dobili oceno od 1a do 2b.
Na dan 5 smo zarodke ocenjevali z ocenami od 1 do 5 glede na delež blastocela znotraj celične mase:
1 – manj kot polovica,
2 – polovica,
3 – več kot polovica,
4 – popolnoma razprta (ekspandirana) blastocista,
5 – razprta blastocista z začetnimi znaki levitve.
Zarodke smo prenesli v maternico z mehkim katetrom (Cook Australia ali Labotect, Nemčija). Prenos smo skušali opraviti atravmatsko, zarodke pa odložiti en centimeter pod materničnim svodom.
Po prenosu zarodkov so vse ženske dobile terapijo za podporo lutealne faze cikla: 30 mg didrogesterona (Dabroston, Duphare, Nizozemska) ali 600 mg progesterona (Utrogestan,
Asta Medica, Nemčija). Nekatere med njimi so 7. dan po punkciji dobile 1500 IE horionskega gonadotropina (Pregnyl, Organon, Nizozemska). Osebe, starejše od 40 let, so v lutealni fazi jemale tudi etinylestradiol 2 mg (Progynova, Scherring, Nemčija) in 0,1 g aspirina (Bayer, Nemčija). Analizo beta hCG v krvi so opravile 16 dni po prenosu zarodkov. V primeru pozitivnega testa so nadaljevale z lutealno podporo še 14 dni. Tri tedne po prenosu zarodkov smo z vaginosonografijo ugotavljali število implantiranih zarodkov in število gestacijskih mešičkov. Teden dni kasneje smo ugotavljali obstoj srčne akcije, s čimer smo potrdili delež vitalnih nosečnosti.

Statistična analiza

Test hi-kvadrat smo uporabili za izračun statistične značilnosti med kvantitativnimi spremenljivkami. Analizo vseh podatkov smo opravili s programom Statistica Statsoft (ZDA).

Rezultati

Analizirali smo sposobnost implantacije zarodkov po prenosu 2 ali 3 dni po oploditvi in 5 dni po oploditvi, ko dosežejo stopnjo blastociste.
V prvi skupini smo prenesli v maternico 1498 zarodkov po dvo- ali tridnevnem kultiviranju zunaj telesa. Tri tedne po prenosu zarodkov smo ugotavljali z ehografsko preiskavo število vgnezdenih zarodkov. Vgnezdilo se je 320 zarodkov (21,3%). Stopnja vgnezditve zarodkov je bila odvisna od števila prenesenih zarodkov. V primerih, ko smo prenesli v maternico le en zarodek, stopnja vgnezditev (v tem primeru tudi zanositve) ni presegla 22,9%. V primeru, ko smo prenesli v maternico 2 zarodka, smo zabeležili stopnjo zanositev med 20,7% in 26% ne glede na morfološki izgled zarodka. V primerih, ko smo v maternico prenesli več kot 2 zarodka, smo zabeležili višje stopnje zanositev (44%-75%). Najnižjo stopnjo implantacije v tej skupini žensk smo vedno zabeležili takrat, ko smo prenesli v maternico le en morfološko dober zarodek. S povečevanjem števila dobrih zarodkov v kohorti zarodkov, namenjenih embriotransferju, je rastel tudi delež večplodnih nosečnosti. Delež večplodnih vgnezditev je bil pri prenosu dveh zarodkov 36,0% (9/25), treh zarodkov 38,4% (50/130) ter štirih zarodkov 50,6% (42/83). 29 (33,7%) zanositev, pri katerih smo opazili več gestacijskih mešičkov, v naslednjih tednih ni razvilo enakega števila plodov ali pa je prišlo do spontanega odmrtja enega ali več zarodkov ter nadaljevalo s razvojem manjšega števila plodov. 15 (14,8%) večplodnih zanositev je končalo s spontanim splavom. Izmed 86 ciklusov, pri katerih je prišlo do vgnezditve več plodov in so se končali s porodom, smo pri 19 (22,1%) ciklusih opazili spontano redukcijo števila zarodkov v prvih 12. tednih nosečnosti. Pri 11 večplodnih nosečnostih smo opravili selektivno prekinitev nosečnosti med 6. in 7. tednom gestacije in zmanjšali število zarodkov na dva. Rodilo se je 62 parov dvojčkov in 5 trojčkov (tab. 1).

Tab. 1. Stopnja vgnezditev zarodkov, spočetih z ICSI, glede na število in kakovost zarodkov ob 557 prenosih drugi dan po oploditvi.

Število zarodkov Število pre- Število dobrih Zanositev na Večplodne nosečnosti
ob prenosu nosov (število zarodkov/vsi pre- prenos (%) (% od zanositev)
(ciklusov) zarodkov) neseni zarodki Multiple pregnancies

Embryos per Embryo- Good quality Pregnancy per (% pregnancies)
transfer transfers embryos/ transfer (%) dvojčki trojčki četverčki
(cycles) (embryos) embryos transferred twins triplets quadriplets
1 zarodek 32 (32) 0/1 5 (15,6)
1 embryo 48 (48) 1.jan 11 (22,9)
-80
2 zarodka 23 (46) 0/2 6 (23,0) 1(16,6)
2 embryos 32 (64) 1.feb 7 (21,9)
-113 58 (116) 2.feb 12 (20,7) 8 (66,6)
3 zarodki 12 (36) 0/3 3 (25,0)
3 embryos 25 (75) 1.mar 11 (44,0) 1 (9,1) 1 (9,1)
-244 36 (108) 2.mar 24 (66,0) 5 (20,8) 2 (8,3)
171 (513) 3.mar 95 (55,5) 30 (31,6) 11 (11,6)
4 zarodki 13 (52) 0/4 6 (46,1) 1 (16,6)
4 embryos 16 (64) 1.apr 6 (37,5) 1 (16,6)
-140 25 (112) 2.apr 14 (56,0) 8 (57,1) 2 (14,3)
28 (232) 3.apr 13 (46,4) 5 (38,4) 1 (7,6)
58 (232) 4.apr 44 (75,8) 10 (22,7) 10 (22,7) 4 (9,1)
Nosečnosti / Pregnancies 257 70 (27,2) 26 (10,1) 5 (1,9)
Porodi / Deliveries 193 62 (32,1) 5 (2,5) 0 (0,0)
Splav,GEU / Abortion, ectopic 64 (24,9)
Nosečih na prenos / Pregnancies per transfer 44,50%
Porodov na prenos / Deliveries per transfer 33,40%

V postopku prenosa zarodkov na razvojni stopnji blastociste smo prenesli v maternico 364 zarodkov. Vgnezdilo se jih je 136 (37,3%). Tudi v primeru prenosa blastocist smo opazili, da je bil delež zanositev odvisen od deleža dobrih zarodkov med tistimi, ki so namenjeni prenosu v maternico. Prenos blastociste slabe kakovosti je imel za posledico tudi nižjo stopnjo vgnezditev (le s 15,8-odstotno stopnjo zanositve). Ob prenosu enega dobrega zarodka (blastociste) v maternico smo zabeležili 46,1% vgnezditev. Med njimi je bila tudi ena dvoplodna nosečnost (4,3% vseh zanositev s prenosom enega zarodka). Pri prenosu dveh zarodkov kakovost zarodkov ni statistično pomembno vplivala na izid postopka, saj smo beležili med 64,3% in 75,7% zanositev ne glede na to, ali je bila dobre kakovosti ena, obe ali nobena od prenesenih blastocist. Med njimi je bilo 38,7% (38/98) večplodnih nosečnosti. Tudi med njimi smo zabeležili eno triplodno nosečnost z enojajčnimi dvojčki (tab. 2).

Tab. 2. Stopnja vgnezditev zarodkov, spočetih z ICSI, glede na število in kakovost zarodkov ob prenosu 5. dan po oploditvi.

Število zarodkov Število Število dobrih Zanositev na Večplodne nosečnosti
ob prenosu prenosov zarodkov/vsi pre- prenos (%) (% od zanositev)
(ciklusov) (blastocist) neseni zarodki Multiple pregnancies

Embryos per Transfers Good quality Pregnancy per (% pregnancies)
transfer (blastocysts) embryos/ transfer (%) dvojčki trojčki četverčki
(cycles) embryos transferred twins triplets quadriplets
1 zarodek 19 (19) 0/1 3 (15,8) 1 (4,8)
1 embryo 39 (39) 1.jan 18 (46,1)
-58
2 zarodka 28 (56) 0/2 13 (64,3) 3 (23,1)
2 embryos 37 (74) 1.feb 28 (75,7) 8 (28,6) 1 (3,5)
-176 88 (176) 2.feb 57 (64,8) 27 (47,4)
Nosečnosti / Pregnancies 119 39 (32,7) 1 (0,8)
Porodi / Deliveries 92 23 (25,0) 1 (1,1)
Splav, GEU / Abortion, ectopic 27 (22,6)
Nosečih na prenos / Pregnancies per transfer 56,5
Porodov na prenos / Deliveries per transfer 39,3

Razpravljanje

Prenos večjega števila zarodkov v maternico omogoča večjo verjetnost zanositve, ker pričakujemo, da se bo vsaj eden od zarodkov vgnezdil. Ob prenosu več zarodkov v maternico prihajata v nasprotje dva interesa: pričakovanje ženske, ki si želi zanositev ne glede na tveganje večplodne nosečnosti, in pravica otroka po najmanj tveganem poteku nosečnosti in porodu, torej enoplodni nosečnosti. Zato je pomembno, da se že pred transferjem dogovorimo o številu zarodkov, ki jih bomo vrnili v maternico.
Ameriško združenje za reproduktivno medicino (8) priporoča prenos treh zarodkov pri ženskah z zelo dobro prognozo, ki so mlajše od 30 let. Pri tistih z dobro prognozo, starih od 30 do 40 let, priporočajo prenos do štirih dobrih zarodkov. Pri tistih ženskah, ki so starejše od 40 let in imajo številne neuspešne poskuse zanositve z biomedicinsko pomočjo, ne priporočajo prenosa več kot petih zarodkov. Omejitve na prenos treh zarodkov ne upoštevajo individualnih značilnosti vsakega para pri oceni verjetnosti za vgnezditev zarodka. Nasprotno temu Angleško združenje za plodnost (9) priporoča prenos največ treh zarodkov v maternico. Menijo, da pri ženskah, starejših od 38 let, ki imajo nižjo sposobnost zanositve, pomeni prenos treh zarodkov še vedno določeno tveganje za triplodno nosečnost, čeprav je tveganje za trojčke pri 40-letni ženski 4,6-krat nižje kot pri ženski, stari 30 do 35 let.
Po podatkih angleškega registra v centrih, kjer opravijo prenos 2 zarodkov v manj kot 15% vseh postopkov zdravljenja, lahko pričakujejo dvojčke v 28% in trojčke v 5% vseh zanositev. V tistih centrih, kjer opravijo prenos dveh zarodkov v več kot 50% vseh postopkov zdravljenja, se le minimalno zmanjša verjetnost za dvoplodno nosečnost (24%), nekaj več pa za triplodno nosečnost (5%) (21).
Med mnogimi dejavniki, ki vplivajo na izid ICSI, je starost najpomembnejša. Vpliv staranja na izid postopka se zrcali že na številu in kakovosti jajčnih celic ter v večji stopnji spontanih splavov. Staranje ne vpliva na uterus oz. njegovo pripravljenost za vgnezditev.
Starejše ženske lahko pričakujejo manjše število aspiriranih jajčnih celic, manj oplojenih jajčnih celic in manj zarodkov (22). Tako se pri starejših skupinah žensk zmanjšujejo tudi možnosti izbire dobrih zarodkov za transfer.
Vgnezditvena (implantacijska) sposobnost zarodkov in preživetje zarodkov sta pri starejših ženskah manjša, kar se kaže v zmanjšani vgnezditvi zarodkov (število implantiranih zarodkov na število prenesenih zarodkov) (23, 24).
Pri zunajtelesni oploditvi je izbor najbolj vitalnega zarodka, z največ možnostmi za vgnezditev, najpomembnejši del postopka. Zato je dolgo veljalo, da je bolje prenesti v maternico večje število zarodkov, da bi se vsaj eden ugnezdil. Posledica tega je bil visok delež večplodnih nosečnosti med ženskami, zdravljenimi s tehnikami oploditve z biomedicinsko pomočjo. Le-ta ni v neposrednem sorazmerju s stopnjo vgnezditve, saj od prvotnega števila vgnezdenih zarodkov velik delež spontano odmre in nosečnost se nadaljuje z manjšim številom plodov. Blumenfeld in sod. (25) poročajo, da se število plodov pri večplodni nosečnosti spontano zmanjša v 43% do 78% nosečnosti. V primeru, ko je večplodna nosečnost s trojčki ali četverčki nesprejemljiva, ostaja kot možna rešitev tudi transvaginalno aspiriranje nadštevilnih gestacijskih mešičkov in redukcija njihovega števila na dva (26). V primeru nezaželene triplodne nosečnosti imajo takšen postopek za opravičen tudi strokovna združenja FIGO, BFS, AFS (8, 9), ob upoštevanju možnosti, da ženska zgubi nosečnost v 15-17%.
Delež večplodnih nosečnosti je med različnimi evropskimi centri kljub enakemu številu prenesenih zarodkov različen (5). Mnogi centri skušajo izboljšati rezultat s podaljšanim kultiviranjem in boljšo selekcijo zarodkov za prenos.
Stopnja fragmentacije zarodka je najpomembnejši kazalec njihove kvalitete (27, 28). Hitrost delitev blastomer je naslednji kazalec kakovosti zarodka (29). Zarodki, ki se delijo počasneje, imajo tudi manjšo možnost za vgnezditev (30). V naši analizi podatkov smo upoštevali stopnjo fragmentacije zarodkov in hitrost delitve.
Ocena kakovosti zarodka samo na osnovi morfološkega izgleda je nezanesljiva. Tudi morfološko neoporečni zarodki so lahko nosilci kromosomskih nepravilnosti. To je še posebej izraženo pri starejših ženskah.
Kakovost zarodkov tudi ni vedno vezana samo za laboratorijske pogoje njihovega razvoja. Vitalnost zarodka je v neposredni zvezi s kakovostjo jajčne celice, iz katere je zarodek nastal, le-ta pa od procesov njene zoritve oz. od razvoja folikla v času zorenja (31, 32). V kohorti aspiriranih jajčnih celic so vedno tudi celice z različnimi stopnjami jedrne in citoplazmatske zrelosti ne glede na uporabljen protokol spodbujanja rasti foliklov. Pomemben dejavnik, ki vpliva na selekcijo zarodkov, je velikost kohorte zarodkov (33). V primeru, da je zarodkov več kot 5, je verjetnost, da dobimo dobre zarodke za prenos, bistveno večja. To dejstvo ima večji vpliv na stopnjo zanositve kot samo število prenesenih zarodkov (34).
Dobra selekcija zarodkov in prenos majhnega števila zarodkov sta pomembna zaradi zmanjševanja tveganja za nastanek večplodne nosečnosti. Iz naših rezultatov je razvidno, da lahko le prenos enega zarodka v maternico reši ta problem, čeprav lahko tudi takrat pričakujemo pojavljanje (enojajčnih) dvojčkov. Ob prenosu dveh zarodkov lahko še vedno pričakujemo dvoplodno nosečnost vsaj v tretjini primerov.
Z izbiro le enega od zarodkov dva dni po oploditvi so možnosti za izbor najbolj ustreznega zarodka majhne, zato bo stopnja zanositev na prenos zarodka nizka. V tem obdobju je razvoj zarodka odvisen še od maternalne transkripcije in ne od aktiviranja lastnega genoma. Razen tega se zarodki v tem obdobju zelo razlikujejo po potencialu, da se razvijejo v blastocisto, sposobno za vgnezditev. Večina med njimi ne bo preživela vseh faz razvoja od dvoceličnega zarodka do stadija razprte blastociste ali celo stadija leveče se blastociste, ko zarodek zapusti ovojnico (zono pelucido).
Prenos enega zarodka v maternico drugi dan po osemenitvi jajčnih celic in zamrzovanje preostalih zarodkov je vprašljivo, saj zaradi nizke stopnje zanositev spodbujanje razvoja foliklov z gonadotropini ni smotrno. V primeru, ko se odločimo za prenos le dveh zarodkov z namenom, da bi se izognili nastanku trojčkov, lahko pričakujemo odstotek zanositev v 30% do 40%, če pa zmanjšamo število prenesenih zarodkov na enega, se bo le-ta znižala na 14% (35). To pomeni, da bo od takšnega pristopa imelo korist le tistih 30% žensk s povečanim tveganjem za nastanek večplodne nosečnosti (dvojčkov), preostalih 70% pa se bo moralo sprijazniti s polovico manjšo uspešnostjo metode. Za tiste s povišanim tveganjem je nepotrebno tudi spodbujanje ovulacije, saj lahko enako stopnjo zanositve dosežemo tudi v primeru prenosa zarodka, nastalega iz jajčne celice nestimuliranega cikla (36). Takšen pristop bi imel dramatične posledice za ženske, starejše od 38 let, kjer je stopnja večplodnih nosečnosti izjemno nizka, kljub prenosu 3 ali 4 zarodkov. Tudi program prenosa odmrznjenih zarodkov je uspešen le, če smo za zamrzovanje selekcionirali zarodke dobre kakovosti. Tudi v tem primeru je smisel prenosa le enega zarodka zaradi nizke kumulativne stopnje zanositve vprašljiv. Poleg tega se poveča število prenosov in z njimi vezani stroški zdravljenja ter čustvene težave ob neuspehu slehernega prenosa zarodkov (37).
Selekcija zarodkov, ki temelji na upoštevanju njihove sposobnosti razvoja do blastociste in vitro, najbolje kaže njihov biološki potencial. Da bi dosegel ta stadij, je zarodek moral preiti več faz razvoja, od aktiviranja lastnega genoma, delitev blastomer, oblikovanja morule, razvoja blastociste in prve diferenciacije celic na celice trofektoderma in celice notranje celične mase.
Danes še ni jasnega mnenja o tem, ali je prenos zarodkov na stopnji blastociste enako dober za vse ženske. Nedvomno se njegova prednost takoj izniči v primeru prenosa treh blastocist, saj s tem tvegamo visok odstotek triplodnih nosečnosti (38). Vemo, da morfološki izgled zarodka drugi ali tretji dan po oploditvi nima dobre napovedne vrednosti za razvoj zarodka do stadija blastociste. Polovica morfološko dobrih zarodkov na dan 3 bo dosegla stopnjo blastociste, vendar bo enako stopnjo doseglo tudi 20% zarodkov, ki so na dan 3 ocenjeni kot slabi (39).
Naši rezultati na neizbrani skupini žensk so ohrabrujoči, saj omogočajo zanositev v odstotku, ki ga nismo dosegli z nobeno od do sedaj uporabljenih tehnik selekcije.
Tako smo v primeru prenosa le enega dobrega zarodka v stadiju blastociste dosegli 46% zanositev na prenos, kar je bilo le nekaj nižje kot takrat, ko smo prenesli dve blastocisti in dosegli 64% zanositev na prenos.

Zaključki

Kljub nedvomno velikemu pomenu večplodnih nosečnosti, ki nastanejo s prenosom zarodkov pri postopkih zunajtelesne oploditve, se le-tem ne moremo popolnoma izogniti. Povprečni delež večplodnih porodov po zanositvi s tehnikami oploditve z biomedicinsko pomočjo je v evropskih centrih 29,6% (25,8% dvojčkov, 3,6% trojčkov in 0,2% četverčkov) (40). Pojavnost večplodnih zanositev po IVF/ICSI je odvisna od različnih doktrin o številu zarodkov, ki jih prenesejo v maternico. V evropskih centrih prenesejo en zarodek le pri 11% ciklov. V 38% vseh ciklov oploditve z biomedicinsko pomočjo prenesejo tri zarodke in v 11% štiri zarodke (40). Kljub temu da je med srednje- in južnoevropskimi državami večina takšnih, kjer vrnejo 4 zarodke v dobri tretjini vseh ciklov zdravljenja, je za nas bolj sprejemljivo priporočilo in praksa nordijskih držav, kjer priporočajo prenos največ dveh zarodkov (40).
Zaradi izjemnega napredka pri kultiviranju zarodkov v in vitro pogojih je nujno upoštevati priporočila za omejitev vnosa na največ dva zarodka pri vseh ženskah z visokim tveganjem za nastanek večplodne nosečnosti. Žal pri takšnem pristopu lahko odpravimo le delež triplodnih nosečnosti med vsemi večplodnimi.
Enak pristop tudi ni primeren za vse ženske, še posebej ne za tiste, starejše od 38 let. Selekcija zarodkov s podaljšanim kultiviranjem do stopnje blastociste izjemno poveča uspešnost prenosa zarodkov kljub omejitvi števila vrnjenih zarodkov na maksimalno dva zarodka. Zaradi velikega odstotka dvoplodnih nosečnosti med tistimi s prenosom dveh blastocist je pomembno selekcionirati tiste med njimi, ki so kandidatke za prenos le enega zarodka. Zaradi možnosti nastanka enojajčnih dvojčkov ni popolnoma izključena niti nepričakovana večplodna nosečnost kljub prenosu ene ali dveh blastocist. Za priporočilo o prenosu le ene blastociste vsem ženskam, ki vstopajo v program zunajtelesne oploditve, še ni medicinsko podprtih dokazov (EBM).

Literatura

1. Janny L, Menezo YJR. Evidence for a strong paternal effect on preimplantation embryo development and blastocyst formation. Mol Reprod Dev 1994; 38: 36-42.
2. Nagy ZP, Liu J, Joris H, Verheyen G et al. The result of intracytoplasmatic sperm injection is not related to any of the three basic sperm parameters. Hum Reprod 1995; 10: 1123-9.
3. Vlaisavljević V, Kovačič B, Gavrić V. Important factors for establishing a successful program of intracytoplasmic sperm injection. In: Intracytoplasmic sperm injection: Basic and clinical aspects. Book of abstracts, Serono Symposia S. A. Thessaloniki, Greece: Serono, 1996: 20-0.
4. Palermo GD, Schlegl PN, Colombero LT, Zaninovic N, Moy F, Rosemwaks Z. Aggressive sperm immobilization prior to intracytoplasmatic sperm injection with immature spermatozoa improves fertilization and pregnancy rates. Hum Reprod 1996; 10: 1023-9.
5. Tarlatzis B. Raport of the activities of the ESHRE task force on the intracytoplasmatic sperm injection. In: Van Steirteghem A, Devroey P, Liebaers eds. Genetics and assisted human conception. Oxford: Oxford University Press, 1996: 160-76.
6. Kodama H, Fuduka J, Karube H et al. Prospective evaluation of simple morphological criteria for embryo selection in double embryo transfer cycles. Hum Reprod 1995; 10: 2999-3003.
7. Devreker F, Emiliani S, Reveland P et al. Comparison of two elective transfer policies of two embryos to reduce multiple pregnancies without impairing pregnancy rates. Hum Reprod 1999; 14: 83-9.
8. American Society for Reproductive Medicine. A Practice Committee Raport: a committee opinion. Guidelines on number of embryos transferred 1998. Hum Reprod 1998; 13: 2669-70.
9. British Fertility Society. Recomandations for good practice. Embryo transfer 1998. Hum Reprod 1998; 13: 2669-9.
10. Templeton A. Avoiding multiple pregnancies in ART: Replace as many embryos as you like – one at a time. Hum Reprod 2000; 15: 1662-2.
11. Vilska S, Tiitinen A, Hyden-Granskog C et al. Elective transfer of one embryo results in an acceptable pregnancy rate and eliminates the risks of multiple birth. Hum Reprod 1999; 14: 2392-5.
12. Puissant F, Van Rysselberge M, Barlow P et al. Embryo scoring as a prognostic tool in IVF treatment. Hum Reprod 1987; 2: 705-8.
13. Staessen C, Nagy YP, Liu J et al. The relationship between embryo quality and the occurrence of multiple pregnancies. Fertil Steril 1992; 57: 626-30.
14. Veeck L. Oocyte assessment and biological performance. Ann NY Acad Sci 1987; 541: 259-74.
15. Sauer VM, Bustillo M, Rodi IA et al. In vivo blastocyst production and ovum yield among fertile women. Hum Reprod 1987; 2: 701-3.
16. Huisman GJ, Fauser BCJM, Eijkemans MJC et al. Implantation rates after in vitro fertilization and transfer of a maximum of two embryos that have undergone three to five days of culture. Fertil Steril 2000; 73: 117-22.
17. Milki AA, Fisch JD, Bahr B. Two-blastocyst transfer has similar pregnancy rates and a decreased multiple gestation rate compared with three-blastocyst transfer. Fertil Steril 1999; 72: 225-8.
18. Gardner DK, Lane M, Stevans J et al. Blastocyst score affects implantation and pregnancy outcome: towards a single blastocyst transfer. Fertil Steril 2000; 73: 1155-8.
19. Vlaisavljević V, Kovačič B, Gavrić-Lovrec V, Reljič M. Simplification of the clinical phase of IVF and ICSI treatment in programmed cycles. Int J Gynecol Obstet 2000; 69: 135-42.
20. Vlaisavljević V, Kovačič B. Naše prve izkušnje s tehniko direktnega vnosa semenčice v citoplazmo jajčne celice pri zdravljenju moške neplodnosti. Zdrav Vestn 1995; 64: 677-9.
21. Human Fertilisation and Embryology Authority. Patients guide to donor insemination in IVF clinics. London: HFEA, 1997.
22. Sharma V, Riddle A, Mason BA, Pampiglione J, Campbell S. An analysis of factors influencing the establishment of a clinical pregnancy in an ultrasound-based ambulatory in vitro fertilization program. Fertil Steril 1988; 49: 468-78.
23. Hull MGR, Fleming CF, Hughes AO, McDermott A. The age-related decline in female fecundity: a quantitative controlled study of implanting capacity and survival of individual embryos after in vitro fertilization. Fertil Steril 1996; 65: 783-90.
24. Van Kooij RJ, Looman CWN, Habbema JDF, Dorland M, te Velde ER. Age-dependent decrease in embryo implantation rate after in vitro fertilization. Fertil Steril 1996; 66: 769-75.
25. Blumenfeldt Z, Dirnfeldt M, Abramovici H et al. Spontaneous fetal reduction in multiple gestations assessed by transvaginal ultrasound. Br J Obstet Gynecol 1992; 99: 333-7.
26. Vlaisavljević V, Borko E. Selective reduction after gamete intrafallopian transfer. Int J Gynecol Obstet 1991: 36: 59-61.
27. Giorgetti C, Terriou P, Auquier P et al. Embryo score to predict implantation after in-vitro fertilization: based on 957 single embryo transfers. Hum Reprod 1995; 10: 2427-31.
28. Alikani M, Cohen J, Tomkin BA et al. Human embryo fragmentation in vitro and its implication for pregnancy implantation. Fertil Steril 1999; 71: 836-42.
29. Edwards RG, Beard HK. Is the success of human IVF more a matter of genetics and evolution than growing blastocysts? Hum Reprod 1999; 14: 1-4.
30. Bavister BD. Culture of preimplantation embryos: facts and artifacts. Hum Reprod Update 1995; 1: 91-148.
31. Jones HW, Acosta A, Andrews M et al. The importance of the follicular phase to successs and failure in in vitro fertilization. Fertil Steril 1983; 440: 317-22.
32. Gregory L. Ovarian markers of implantation potential in assisted reproduction. Hum Reprod 1998; 13: Suppl 4: 117-32.
33. Devreker F, Govaerts I, Bertrand E et al. The long-acting gonadotropin-releasing hormone analogues impaired the implantation rate. Fertil Steril 1996; 65: 122-6.
34. Templeton A, Morris JK. Reducing the risk of multiple births by transfer of two embryos after in vivo fertilization. N Engl J Med 1998; 339: 573-7.
35. Gerris J, Van Royen E. A plea for single embryo transfer. Hum Reprod 2000; 15: 1884-8.
36. Vlaisavljević V, Kovačič B, Reljič M, Gavrić-Lovrec V. Comparison of three different protocols for monitoring of follicle development in 587 unstimulated cycles for IVF and ICSI. J Reprod Med 2001, v tisku.
37. Hernandez ER. Avoiding multiple pregnancies: sailing uncharted seas. Hum Reprod 2001; 16: 615-6.
38. Milki AA, Hincklley MD, Fisch JD et al. Comparison of blastocyst transfer with day 3 embryo transfer in similar patient populations. Fertil Steril 2000; 73: 126-9.
39. Rijders PM, Jansen CAM. The predictive value of day 3 embryo morphology regarding blastocyst formation, pregnancy and implantation rate after day 5 transfer following in-vitro fertilization or intracytoplasmic sperm injection. Hum Reprod 1998; 13: 2869-73.
40. Nigran A. More than 200,000 ART cycles annually in Europe’s first report. Organon IVF News 2001; 12: 5-5.

____________________________________________________________________

REZULTATI IN VITRO ZORENJA MEJOTSKO NEZRELIH ČLOVEŠKIH JAJČNIH CELIC V ENOSTAVNEM GOJIŠČU
Strokovni prispevek

——————————————————————————–

Borut Kovačič, Veljko Vlaisavljević
Oddelek za reproduktivno medicino in ginekološko endokrinologijo, Služba za ginekologijo in perinatologijo, Splošna bolnišnica, Ljubljanska 5, 2000 Maribor

Prispelo 2001-01-10, sprejeto 2001-04-26; ZDRAV VESTN 2002; 71: Supl. I: 13-7
Ključne besede: jajčna celica; redukcijska delitev; zorenje in vitro; oploditev; klinična uporaba

Izvleček – Izhodišča. V raziskavi ugotavljamo, kolikšen je med jajčnimi celicami, ki jih dobimo pri aspiraciji preovulatornih jajčnih foliklov v hormonsko spodbujanih ciklih, delež nezrelih jajčnih celic z jedrom v metafazi (M I oociti) ali celo profazi (GV oociti) prve redukcijske delitve in kakšna je sposobnost zorenja jajčnih celic in vitro v preprostem gojišču brez dodanih hormonov.

Metode. Pri 818 ženskah, spodbujanih z agonisti sproščevalcev gonadotropinov (GnRHa) in gonadotropini, smo po aspiraciji preovulacijskih jajčnih foliklov dobili 4972 jajčnih celic. Le-tem smo odstranili celice kumulusa ooforusa in korone radiate in pod mikroskopom ocenili mejotsko zrelost. Celice v metafazi druge redukcijske delitve (M II oociti) in tiste, ki so dozorele po 5 urah, smo uporabili klinično v postopku intracitoplazmatskega injiciranja semenčice v jajčno celico (ICSI). Preostale nezrele celice smo pustili v enostavnem gojišču. Stanje njihove jedrne zrelosti smo ocenjevali po enem oziroma dveh dnevih zorenja. In vitro zorenje jajčnih celic smo klinično uporabili tudi v 14 ciklih z vsemi nezrelimi celicami.

Rezultati. Med 4731 jajčnimi celicami z odstranjeno korono in kumulusom je bilo 4199 (88,8%) zrelih M II oocitov, 295 (6,2%) nezrelih M I oocitov in 237 (5%) nezrelih GV oocitov. V pogojih in vitro je dozorelo 68,7% (90/131) GV oocitov. Med M I oociti je 63,6% (136/214) celic dozorelo že po 5 urah in 26,6% (57/214) do naslednjega dne. Pri vseh 14 ženskah s samo nezrelimi jajčnimi celicami na dan aspiracije smo po zorenju in vitro in ICSI postopku pridobili zarodke za prenos. Dosegli smo 4 nosečnosti in dve rojstvi.

Zaključki. Nezrele jajčne celice, ki jih dobimo v hormonsko spodbujanih ciklih, lahko postanejo klinično uporabne, če jih pustimo zoreti in vitro v enostavnem gojišču brez dodanih rastnih faktorjev in hormonov.

Uvod

Hormonsko spodbujanje ovulacije pri ženskah z agonisti sproščevalcev gonadotropinov (GnRHa) in folikle stimulirajočim hormonom (FSH) povzroči zorenje več kohort foliklov. V času hormonskega zdravljenja se stanje jedra jajčne celice ne spreminja. Jedro vsebuje pare homolognih kromosomov in ostaja v profazi prve redukcijske delitve, v kateri je od rojstva ženske. Pod mikroskopom ga opazimo kot germinalni vezikel (GV). Šele dajanje humanega horioničnega gonadotropina (hCG) v fazi preovulacijske velikosti foliklov, ki nadomesti biološki dvig koncentracije luteinizirajočega hormona (LH), spodbudi jedro jajčne celice posredno preko drugih mehanizmov k nadaljevanju redukcijske delitve (1). Iz mirujočega diktiotenskega stadija profaze (GV oocit) preide jedro v metafazo prve (M I oocit) in nato v metafazo druge redukcijske delitve (M II oocit), ko počaka na združitev s semenčico. Ta prehod se zgodi tik pred ovulacijo.
V postopku zunajtelesne oploditve (IVF) dobimo jajčne celice iz foliklov različne velikosti in zrelosti. Encimsko in mehansko odstranjevanje celic kumulusa ooforusa in korone radiate od jajčne celice nam omogoči ocenjevanje njene mejotske zrelosti. Pogosto lahko opazimo, da nekatere od jajčnih celic, dobljenih v hormonsko spodbujanih ciklih, kljub dajanju hCG ne uspejo jedrno dozoreti in vivo. Zaradi neustreznega mejotskega razvoja oocitov takšne nezrele celice navadno ne uporabimo v klinične namene.
Mejotsko dozorevanje jajčne celice lahko poteka tudi in vitro. Prvo poročilo o zorenju človeških jajčnih celic in vitro sega v leto 1965 (2), vendar je bila prva nosečnost zabeležena šele 18 let kasneje (3), ko so nezrele celice iz hormonsko spodbujanih ciklov z FSH in hCG uporabili v postopku IVF. Zrelost jajčnih celic so ocenjevali po velikosti kumulusa ooforusa in po širini korone radiate, njihova jedrna zrelost pa je bila neznana. Šele leta 1991 so dosegli nosečnost po pravem zorenju jajčnih celic in vitro, ki so jih dobili iz 2 do 5 mm velikih foliklov v naravnih ciklih po ovariektomiji (4).
Nosečnosti z uporabo hormonsko nespodbujanih jajčnih celic pri človeku, dozorelih in vitro, so redke (4-7). Še redkeje pa zasledimo nosečnosti iz jajčnih celic, ki so ostale nezrele kljub danemu hCG in so dozorele in vitro (8, 9).
V naši študiji poročamo o uspešnosti zorenja GV in M I oocitov iz hormonsko spodbujanih ciklov v preprostih pogojih in vitro in o prvih kliničnih nosečnostih, doseženih z uporabo jajčnih celic, dozorelih in vitro.
Raziskavo je odobrila Komisija za medicinsko etiko pri Ministrstvu za zdravstvo Republike Slovenije.

Material in metode

Hormonsko spodbujanje ovulacije

Pri 818 ženskah, vključenih v program spodbujanja ovulacije zaradi zdravljenja neplodnega para, smo z GnRHa povzročili desenzibilizacijo hipofize. Zdravilo smo dali med 18. in 20. dnem menstruacijskega cikla. Po 14 do 21 dneh smo pričeli s spodbujanjem ovulacije s čistim FSH. Razvoj jajčnih foliklov smo sledili z ultrazvokom. Ko je predovulacijski folikel dosegel premer 18 mm, smo dali 10.000 IE hCG. Vsebino jajčnih foliklov smo aspirirali 36 ur po dajanju hCG.

Zorenje jajčnih celic in vitro

V tekočini iz foliklov smo iskali jajčne celice. Najdene celice smo prenesli v gojišče s pufrom HEPES (Flushing medium, Medicult, Danska). Celice kumulusa ooforusa in korone radiate smo odstranili encimsko s 30-sekundnim izpostavljanjem jajčne celice hialuronidazi (80 mIE/ml; Medicult, Danska) in mehansko s pipetiranjem jajčne celice skozi zoženo kapilaro. Očiščenim celicam smo ocenjevali jedrno zrelost oziroma fazo redukcijske delitve. Merilo za ocenjevanje je bila prisotnost prvega polarnega telesa oziroma germinalnega vezikla. Zrele M II oocite, ki so imeli izločeno prvo polarno telo (sl. 3), smo uporabili klinično v postopku ICSI. Nezrele M I oocite smo prepoznali po odsotnosti polarnega telesa v perivitelinskem prostoru (sl. 2), GV oocite pa po prisotnosti germinalnega vezikla (sl. 1).

Sl. 1. Nezrela jajčna celica v profazi prve redukcijske delitve z jedrom v obliki germinalnega vezikla (GV).

Sl. 2. Nezrela jajčna celica v metafazi prve redukcijske delitve. Germinalni vezikel se je razgradil, v perivitelinskem prostoru pa še ni izločenega prvega polarnega telesa

Sl. 3. Zrela jajčna celica v metafazi druge redukcijske delitve. Ena garnitura homolognih kromosomov se je izločila s prvim polarnim telesom (PT).

Vsako nezrelo jajčno celico brez celic kumulusa ooforusa ali korone radiate smo prenesli v 15 ľl kapljico enostavnega gojišča (IVF medium, Medicult, Danska) v petrijevki, prekrito s parafinskim oljem. Gojišču nismo dodali hormonov, rastnih faktorjev ali krvnega seruma. Celice smo gojili v inkubatorju pri 37 °C, 5% CO2 in 95% relativni vlažnosti.
Prvo ocenjevanje dozorelosti smo opravili že po 5 urah, pred koncem delavnika. Tiste nezrele celice, ki so v tem času dozorele, smo uporabili klinično za postopek ICSI. Stopnjo oplojenosti pri njih smo primerjali s kontrolno skupino, ki so jo predstavljali zreli M II oociti. Preostale jajčne celice smo pustili zoreti do naslednjega dne.
Po enem dnevu dozorele jajčne celice smo uporabili za postopek ICSI samo, če pri bolnici na dan aspiracije foliklov nismo našli nobene zrele celice. V tem primeru smo v jajčne celice vbrizgali semenčice iz svežega semenskega vzorca njihovih partnerjev.

Izbira parov za ICSI

Indikacije za postopek ICSI so bile: a) nizka koncentracija semenčic v semenskem izlivu ( 20 IE/L), LH pa 4,69 ą 2,17 IE/L. Indikacija za postopek IVF/ICSI je bila samo ženska neplodnost (n = 74), samo moška neplodnost (n = 48), ženska in moška neplodnost (n = 16) in nepojasnjena neplodnost (n = 38). Pri 21 bolnicah z žensko neplodnostjo smo prej z laparoskopijo in/ali histerosalpingografijo ugotovili hidrosalpingse. V 222 ciklusih smo naredili postopek IVF v 118 ciklusih pa ICSI.
Vaginalni ultrazvočni pregled in določanje serumskih vrednosti E2 smo opravili 2. dan menstruacijskega ciklusa. Če je bila bazalna vrednost E2 > 0,3 nmol/L, nismo nadaljevali postopkov. Vaginalni ultrazvočni pregled in odvzem krvi za določanje serumske koncentracije E2 smo nato ponavljali vsak drugi dan od 7.-8. DMC naprej in vsakodnevno, ko je bil povprečni premer folikla > 12 mm in serumska koncentracija E2 > 0,35 nmol/L. Cikluse, pri katerih nismo opazili dominantnega folikla do 15. dne menstruacijskega ciklusa, nismo vključili v raziskavo. Injekcijo HCG (5000 IE) smo dali, ko je bil povprečni premer folikla > 15 mm in vrednost E2 > 0,5 nmol/L. 35-37 ur po HCG injekciji smo naredili ultrazvočno vodeno punkcijo foliklov le, če tik pred injekcijo HCG nismo ugotovili LH v urinu.
Folikle smo merili z ultrazvočno napravo Aloka SSD 1700 z 7,5 MHz vaginalnim tipalom. Serumske koncentracije E2 smo določali z encimo-imunsko tehniko (AXSYM; Abbott, Germany). Prezgodnji LH smo ugotavljali z urinskim testom (RAPITEST; Morwell Diagnostic; Swiss).
Jajčne celice smo kultivirali, inseminirali, ugotavljali oploditev in prenesli zarodke, kot je opisano v literaturi (19). Zarodke smo prenesli 2. ali 3. dan po punkciji foliklov. Za podporo lutealne faze so bolnice prejemale HCG (1500 IE) i. m. na dan prenosa zarodka in 4 dni kasneje. Nosečnost smo ugotavljali s serumskim določevanjem HCG 16 dni po prenosu zarodkov in jo potrdili 14 dni kasneje le, če smo z ultrazvočnim pregledom videli gestacijsko vrečko.
Skupini uspešnih in neuspešnih ciklusov smo primerjali s t-testom. Kumulativno stopnjo zanositev smo izračunali z analizo življenjskih tablic. P vrednosti 20 IE/L lahko pride do oblikovanja dominantnega folikla. Pri punkciji dobimo jajčno celico, ki se oplodi, vendar se zarodek v teh ciklusih ne vgnezdi. V naši raziskavi ne ugotavljamo statistično pomembne razlike v povprečnih bazalnih vrednostih FSH med uspešnimi in neuspešnimi naravnimi ciklusi. Potrebno pa je poudariti, da je le ena bolnica imela vrednost FSH > 20 IE/L in ta ni zanosila. Seibel s sod. (10) je tudi mnenja, da na osnovi bazalne vrednosti FSH ne moremo predvideti uspešnost ciklusa. Večji pomen pripisuje bazalnim vrednostim LH, saj ugotavlja nižje vrednosti LH v ciklusih z zanositvijo. Mi tudi teh rezultatov nismo uspeli potrditi, saj nismo ugotovili statistično pomembne razlike v bazalnih vrednostih LH med uspešnimi in neuspešnimi ciklusi.
Statistično pomembne razlike med tema skupinama tudi nismo ugotovili v trajanju neplodnosti, debelini endometrija in povprečnim ter maksimalnim premerom folikla na dan injekcije HCG. Tudi drugi avtorji tem dejavnikom ne pripisujejo posebne vrednosti (5, 15, 16). Glede vrednosti E2 na dan injekcije HCG pa so mnenja deljena. Tomaževič in sod. (15) in Daya s sod. (5) ne ugotavljata razlike v povprečnih vrednostih E2 med uspešnimi in neuspešnimi ciklusi. Paulson s sod. (16) pa meni, da je pri višjih vrednostih E2 večja možnost zanositve. Tudi naši rezultati kažejo, da je pričakovati višji delež zanositev na punkcijo pri višjih vrednostih E2 in kasnejšem vbrizganju HCG. Te ugotovitve lahko pojasnimo s fiziologijo menstruacijskega ciklusa. V normalnem menstruacijskem ciklusu se vrednosti E2, pri katerih nastopi spontani LH vrh, gibljejo med 0,451 nmol/L – 3,071 nmol/L (25). Če damo HCG kasneje in pri višji vrednosti E2, je večja verjetnost, da je jajčna celica dosegla primerno zrelost, zato je večja možnost zanositve. Pri čakanju na višjo vrednost E2 pa je tudi večja verjetnost, da pride do spontanega vrha LH, kar vodi v prezgodnjo ovulacijo in neuspeh ciklusa. V vsakem primeru je določen delež ciklusov, pri katerih čas injekcije HCG ni optimalen, kar zmanjšuje uspešnost ciklusov. Zato ne preseneča, da je delež nosečnosti na injekcijo HCG v naravnih ciklusih IVF sorazmerno nizek in podoben kljub različnim merilom in vrednostim E2 na dan vbrizganja HCG. V literaturi se priporočila za vbrizganje HCG v naravnih ciklusih zelo razlikujejo (0,4 nmol/L – 1,1 nmol/L) (15, 3). Tako Paulson (7) kot Seibel (22) sta mnenja, da je smiselno, da si merila za injekcijo HCG izoblikuje vsak center zase. Kajti testi za določanje E2 v serumu so različni. Različen je tudi čas od določanja E2 do injekcije HCG. Po večletnih izkušnjah z naravnimi ciklusi se nam zdi najprimerneje vbrizgati HCG pri vrednostih E2 ??0,5 nmol/L in povprečnem premeru folikla ??15 mm. Ob upoštevanju teh meril smo dosegli primeren delež zanositev na punkcijo ob sprejemljivem deležu prezgodnjih ovulacij.
Popolnoma jasno je, da je delež zanositev na ciklus višji v spodbujanih ciklusih. Upoštevati pa je potrebno, da je naravni ciklus IVF enostavnejši, hitrejši, manj invaziven in povezan z manj neželenimi stranskimi učinki v primerjavi s spodbujanimi ciklusi IVF (9). Po izračunih Daya s sod. (5), Cooka in Lentona (12) pa so tudi stroški na rojenega otroka v naravnem ciklusu IVF najmanj 2-krat nižji v primerjavi s stroški na rojenega otroka v spodbujanem ciklusu. Na ta dejstva se opirajo avtorji, ki so prepričani, da imajo naravni ciklusi pomembno vlogo pri zdravljenju neplodnosti (5, 7, 12, 15, 22). Priporočajo najmanj tri naravne cikluse, kajti možnost zanositve se vsaj v prvih treh ciklusih ne zmanjšuje (7). To je razvidno tudi iz naših rezultatov. Po treh ciklusih lahko pričakujemo, da bo zanosila več kot četrtina neplodnih parov.
Zavedati pa se je potrebno, da so naravni ciklusi primerni le za bolnice, mlajše od 40 let z ovulacijskimi ciklusi. V nasprotju s splošnim prepričanjem pa menimo, da bolnice ni smiselno izbirati na osnovi vzroka neplodnosti, kajti zadovoljiv delež zanositev lahko dosežemo pri vseh bolnicah, pri katerih so potrebni postopki zunajtelesne oploditve. To pa velja le, če pri moški neplodnosti, tako kot v spodbujanih ciklusih, naredimo postopek ICSI.

Literatura

1. Edwards RG, Steptoe PC, Purdy JM. Establishing full-term human pregnancies using cleaving embryos grown in vitro. Br J Obstet Gynecol 1980; 87: 737-56.
2. Stepoe PC, Edwards RG. Birth after the reimplantation of a human embryo. Lancet 1978; II 366-6.
3. Paulson RJ, Sauer MV, Lobo RA. In vitro fertilization in unstimulated cycles: a new application. Fertil Steril 1989; 51: 1056-60.
4. Garcia J. Return to the natural cycle for in vitro fertilization/Alleluia, alleluia!/. J Vitro Fert Embryo Transfer 1989; 6: 67-8.
5. Daya S, Gunby J, Hughes EG, Collins JA, Sagle MA, Young Lai EV. Natural cycles for in vitro fertilization: cost-effectiveness analysis and factors influencing outcome. Hum Reprod 1995; 10: 1719-24.
6. Fahy UM, Cahill DJ, Wardle PG, Hull MGR. In-vitro fertilization in completely natural cycles. Hum Reprod 1995; 10: 572-5.
7. Paulson RJ. Natural cycle in vitro fertilization. Infertil Reprod Med Clin North Am 1993; 4: 653-65.
8. Vlaisavljević V, Gavrić V, Kovačič B. In vitro fertilization in natural cycles: Maribor experience. In: Aburumieh A, Bernat E, Dohr G, Feichtinger W, Fischl F, Huber J, Müller E, Szalay S, Urdl W, Zech H eds. Reprinted from 9th World Congress on In Vitro Fertilization and Assisted Reproduction; 3-7 April 1995; Viena (Austria). Bologna: Monduzzi Editore, 1995: 573-5.
9. Lenton EA, Woodward B. Controversies in assisted reproduction. Natural versus stimulated cycles in IVF: Is there a role for IVF in natural cycle? J Assist Reprod and Genet 1993; 10: 406-8.
10. Seibel MM, Kearnan M, Kiessling A. Parameters that predict success for natural cycle in vitro fertilization-embryo transfer. Fertil Steril 1996; 63: 1251-4.
11. Monks NJ, Turner K, Hooper MAK, Kumar A, Verma S, Lenton EA. Development of embryos from natural cycle in-vitro fertilization: impact of medium type and female infertility factors. Hum Reprod 1993; 8: 266-71.
12. Cooke ID, Lenton EA. Folliculogenesis – The natural way. Aust NZJ Obstet Gynaecol 1994; 34: 268-71.
13. Zayed F, Lenton EA, Cooke ID. Natural cycle in-vitro fertilization in couples with unexplained infertility: impact of various factors on outcome. Hum Reprod 1997; 12: 2402-7.
14. Lindheim SR, Sauer MV, Francis MM, Macaso TM, Lobo RA, Paulson RJ. The significance of elevated early follicular-phase follicle stimulating hormone (FSH) levels: Observations in unstimulated in vitro fertilization cycles. J Assist Reprod Genet 1996; 13: 49-52.
15. Tomaževič T, Geršak K, Meden-Vrtovec H, Drobnič S, Veble A, Valenčič B et al. Clinical parameters predict the success of in vitro fertilization-embryo transfer in natural cycles. Assisted Reprod 1999; 9: 149-56.
16. Paulson RJ, Sauer MV, Francis MM, Macaso TM, Lobo RA. Factor affecting pregnancy success of human in-vitro fertilization in unstimulated cycles. Hum Reprod 1994; 9: 1571-5.
17. Reljič M, Vlaisavljević V. The preovulatory serum estradiol pattern in natural IVF/ICSI cycles. J Assist Reprod and Genet 1999; 16: 535-9.
18. Reljič M, Vlaisavljević V, Gavrić-Lovrec V, Kovačič B, Čižek-Sajko M. The value of serum estradiol level on the day of HCG injection and on the day after in predicting the outcome in natural IVF/ICSI cycles. Fertil Steril 2001; 75: 539-43.
19. Vlaisavljević V, Kovačič B, Gavrić V. In vitro fertilization program based on programmed cycles monitored by ultrasound only. Int J Gynecol Obstet 1992; 39: 227-31.
20. Claman P, Domingo M, Garner P, Leader A, Spence JEH. Natural cycle in vitro fertilization-embryo transfer at the University of Ottawa: an inefficient therapy for tubal infertility. Fertil Steril 1993; 60: 298-302.
21. Foulot H, Ranoux C, Dubuisson JB, Rambaud D, Aubriot FX, Poirot C. In vitro fertilization without ovarian stimulation: a simplified protocol applied in 80 cycles. Fertil Steril 1989; 52: 617-21.
22. Seibel MM. The natural cycle for in vitro fertilization. In: Seibel MM, Richard E eds. Ovulation induction. New York: Blackwell, Raven Press, Ltd., 1994: 223-8.
23. Norman RJ, Payne D, Matthews CD. Pregnancy following intracytoplasmic sperm injection (ICSI) of a single oocyte in a natural cycle. Hum Reprod 1995; 10: 1626-7.
24. Strandell A, Lindhard A, Waldenstrom U, Thorburn J, Janson PO, Hamberger L. Hydrosalpings and IVF outcome: a prospective, randomized multicentre trial in Scandinavia on salpingectomy prior to IVF. Hum Reprod 1999; 14: 2762-9.
25. Cahill DJ, Wardle PG, Harlow CR, Hull MGR. Onset of the preovulatory luteinizing hormone surge: diurnal timing and critical follicular prerequisites. Fertil Steril 1998; 70: 56-9.

_____________________________________________________________________

ZNAČILNOSTI RAZMNOŽEVANJA KUMULUSNIH CELIC DOMINANTNEGA FOLIKLA V IN VITRO POGOJIH
Strokovni prispevek

——————————————————————————–

Mojca Čižek-Sajko, Veljko Vlaisavljević
Služba za ginekologijo in perinatologijo, Oddelek za reproduktivno medicino in ginekološko endokrinologijo, Splošna bolnišnica, Ljubljanska 5, 2000 Maribor

Prispelo 2001-01-10, sprejeto 2001-12-03; ZDRAV VESTN 2002; 71: Supl. I: 25-29
Ključne besede: kultiviranje kumulusnih celic; morfologija kumulusnih celic; oploditev; kakovost zarodka

Izvleček – Izhodišča. Proučevali smo sposobnost razmnoževanja kumulusnih celic dominantnega folikla v in vitro pogojih pri naravnih ciklih zunajtelesne oploditve. Zanimalo nas je, ali se obnašanje kumulusnih celic v kulturi odslikava tudi v oploditveni sposobnosti jajčne celice in v kakovosti zarodka.

Metode. Pri 69 preiskovankah smo v postopku zunajtelesne oploditve s punkcijo folikla dobili kompleks jajčna celica – kumulus. Dan po punkciji smo ocenili obliko kumulusnih celic in oploditev. Po treh dneh kultiviranja smo ocenili razmnoževanje kumulusnih celic in na dan prenosa zarodka, to je tretji dan po punkciji, ovrednotili tudi kakovost zarodka.

Rezultati. Spreminjanje oblike kumulusnih celic iz kroglaste v zvezdasto smo po enem dnevu kultiviranja opazili pri 87,0% vzorcev celic, pri 5,8% vzorcev so se celice pritrdile na podlago, vendar so ohranile kroglasto obliko, pri 7,2% vzorcev pa so kumulusne celice ostale v suspenziji. Po treh dneh kultiviranja so se kumulusne celice dobro razmnoževale pri 65,2% vzorcev, pri 34,8% vzorcev pa je bilo razmnoževanje le neznatno oziroma ga ni bilo. Primerjava spreminjanja oblike kumulusnih celic po enem dnevu kultiviranja in razmnoževanja, ocenjenega po treh dneh kultiviranja, je pokazala njuno medsebojno povezanost. Nismo našli povezanosti med sposobnostjo razmnoževanja kumulusnih celic in oploditveno sposobnostjo jajčne celice, lahko pa smo potrdili odvisnost med sposobnostjo razmnoževanja kumulusnih celic in morfologijo zarodka.

Zaključki. Kumulusne celice v in vitro pogojih izražajo različno sposobnost spreminjanja oblike in različno sposobnost razmnoževanja. Na podlagi vzorca razmnoževanja kumulusnih celic lahko sklepamo na kakovost zarodka, ne pa tudi na oploditveno sposobnost jajčne celice.

Uvod

Kumulusne celice (cumulus oophorus), ki v foliklu tesno obdajajo jajčno celico, se po ovulacijskem vrhu luteinizirajočega hormona (LH) oziroma po dajanju LH ali humanega horionskega gonadotropina (hCG) morfološko in funkcionalno spremenijo (1, 2). Izločati začnejo velike količine hialuronana (HA), glikozaminoglikana z veliko molekularno težo. Nasprotno pa granulozne celice foliklove stene ne tvorijo s HA bogatega medceličnega matriksa in ob ovulaciji ostanejo v foliklu (3). Nekateri menijo, da razvoj granuloznih celic v granulozne celice foliklove stene in kumulusne celice parakrino nadzoruje jajčna celica z izločanjem določenih topnih dejavnikov (4) in da je od razdalje granuloznih celic od jajčne celice odvisno, kako se bodo granulozne celice morfološko in biokemično izrazile (5). Znano je, da je v naravnem ciklu ženske mejotska zrelost jajčne celice povezana s povečanjem stopnje razpršenosti kumulusne mase in s tvorbo viskoznega medceličnega matriksa (6). Matriks povečanega in razpršenega kompleksa kumulus – jajčna celica pospeši izluščenje le-tega iz folikla in skupaj s kumulusnimi celicami ustvarja primerno okolje za prodiranje semenčic do jajčne celice in za oploditev (7). Hialuronanska komponenta matriksa se namreč veže na proteinske receptorje PH-20 na površini semenčice in tako semenčici olajša akrosomsko reakcijo (8).
Sposobnost morfološkega spreminjanja in razmnoževanja izražajo kumulusne celice tudi v in vitro pogojih. Študije folikularnih celic pri spodbujenih postopkih zunajtelesne oploditve (IVF) so pokazale, da se obnašanje kumulusnih celic v kulturi zrcali v oploditveni sposobnosti jajčne celice (9), v kakovosti zarodka (9, 10) oziroma v sposobnosti zarodka, da se vgnezdi (11).
Znano je, da na razvoj folikla in zorenje jajčne celice v folikularni fazi menstrualnega cikla vpliva hormonsko mikrookolje. Gonadotropini, ki jih uporabljamo pri spodbujanju ovulacije med IVF postopkom, lahko vplivajo na normalno funkcijo kumulusnih celic. Geršak in Tomaževič (12) sta proučevala celice granuloze iz foliklov naravnega ciklusa in ciklusa, spodbujenega z gonadotropini. Ugotovila sta, da se razlikujejo v morfometričnih lastnostih in v prisotnosti hCG na celicah ali znotraj njih. Poleg tega lahko v IVF postopku sledimo razvoju jajčne celice od oploditve do razvoja zarodka in njegove vgnezditve. Ta razvoj lahko primerjamo z morfološkimi in mitotskimi lastnostmi pripadajočega kumulusa samo pri zarodkih, nastalih iz foliklov nespodbujenega ciklusa, kjer s punkcijo folikla dobimo le eno jajčno celico.
Namen naše študije je bil proučiti sposobnost razmnoževanja kumulusnih celic in vitro pri naravnih ciklih IVF in ugotoviti, ali se obnašanje kumulusnuh celic v kulturi odslikava tudi v oploditveni sposobnosti jajčne celice in v kvaliteti zarodka.

Material in metode

S prospektivno raziskavo smo analizirali kumulusne celice pri 69 naravnih ciklih IVF. V raziskavo smo vključili pare, ki so bili na seznamu za postopek spodbujenega cikla umetne oploditve in smo jim hkrati ponudili možnost sodelovanja pri naravnih ciklih IVF. Med temi smo izbrali le pare, pri katerih so preiskovanci ustrezali merilom za klasični postopek IVF, tj. da smo po osamitvi semenčic iz semenskih vzorcev s tehniko swim-up lahko pripravili semenske vzorce s koncentracijo gibljivih semenčic 5-10 × 106/ml. Razvoj folikla smo spremljali z ultrazvokom in določanjem ravni estradiola v serumu. Ovulacijo smo pri preiskovankah spodbudili s 5000 IE hCG, ko je premer folikla dosegel 16 mm in raven estradiola vsaj 0,49 nmol/L. Čez 36 ur smo s punkcijo dominantnega folikla dobili kompleks jajčna celica – kumulus (dan 0) in ga prenesli v 0,7 ml gojišča IVF (MediCult, Danska). Po 1- do 2-urni inkubaciji v inkubatorju pri 37 °C in atmosferi s 5% CO2 smo gojišču s kompleksom jajčna celica – kumulus dodali 30 ľl pripadajočega semenskega vzorca s 5-10 × 106/ml gibljivih semenčic, opranega v gojišču SPM (MediCult, Danska) in pripravljenega s tehniko swim-up. Na dan 0 smo tudi ocenili zrelost kompleksa jajčna celica – kumulus. Glede na značilnosti kumulusnih celic, ki obdajajo jajčno celico (cumulus oophorus), in celic, ki so tesno povezane z ovojnico jajčne celice ali zono pellucido (krona, corona radiata), smo razlikovali med petimi tipi kompleksa jajčna celica – kumulus: (I.) nezrel: kumulusne celice v gostem matriksu, nerazpršene ali rahlo razpršene, krona kompaktna, temna; (II.) intermediarni: kumulus nerazpršen ali razpršen, krona rahlo razpršena; (III.) zrel: kumulusne celice močno razpršene, krona svetla in razpršena; (IV.) luteiniziran: kumulusne celice in celice krone temne in zbite v skupke ter (V.) degeneriran: kumulus in krona razpršena, zona pellucida počena, ooplazma degenerirana. Vsi ocenjeni kompleksi so bili zreli. Dan po punkciji smo jajčno celico mehansko ločili od kumulusnih celic, ocenili oploditev in jajčno celico prestavili v sveže gojišče. Na dan prenosa zarodka, to je tretji dan po punkciji, smo ovrednotili kakovost zarodka. Pri ocenjevanju smo upoštevali dve merili: (I.) morfologijo (fragmentiranost blastomer) in (II.) ustreznost dinamike delitve blastomer. Zarodke smo po teh merilih razdelili v dve skupini: skupina A – zarodki dobre kakovosti, tj. zarodki z nefragmentiranimi ali rahlo fragmentiranimi blastomerami ( 50%) ali z neustrezno hitrostjo delitve blastomer (število blastomer se je povečalo z dneva 2 na dan 3 za manj kot 2 blastomeri).
Ob ocenjevanju oploditve smo dan po punkciji z invertnim mikroskopom IMT-2 (Olympus) ocenili tudi morfologijo kumulusnih celic. Razlikovali smo med dvema tipoma celic: kroglaste in zvezdaste. Vzorec kumulusnih celic smo ovrednotili kot celice s kroglasto obliko, če so vse celice v kulturi ostale kroglaste. Če pa je viden delež kumulusnih celic kazal zvezdasto obliko, smo tak vzorec ovrednotili kot celice z zvezdasto obliko. Zanimalo nas je, kako se kumulusne celice obnašajo v in vitro pogojih. Opazovali smo viskoznost kumulusne mase oziroma stopnjo razpršenosti. Glede na to smo razlikovali: (I.) viskozni medcelični matriks – celice v kulturi so v obliki kompaktnega skupka in (II.) razgrajeni medcelični matriks – kumulusna masa se razprši v manjše skupke in v posamezne celice. Ocenili smo sposobnost kumulusnih celic, da se pritrdijo na podlago, in sposobnost preoblikovanja iz kroglaste oblike v zvezdasto obliko s citoplazemskimi izrastki.
Kumulusne celice smo v istem gojišču kultivirali še dva dni, nato pa smo na dan 3 ponovno ocenili sposobnost kumulusnih celic za spreminjanje kroglaste oblike v zvezdasto, ovrednotili razpršenost celic kumulusne mase in njihovo razmnoževanje. Celice so se dobro razmnoževale, če jih je bila večina zvezdaste oblike in so se med seboj povezovale s citoplazemskimi izrastki. Sicer smo ovrednotili njihovo razmnoževanje kot slabo.
Kultiviranje smo pri delu vzorcev podaljšali na pet oziroma na sedem dni z menjavo gojišča vsak drugi dan.
Za statistično obdelavo podatkov smo uporabili računalniški program Statistika StatSoft. Povezavo med spreminjanjem oblike kumulusnih celic po enem dnevu kultiviranja in vzorcem razmnoževanja po treh dneh kultiviranja, odnos med razmnoževanjem kumulusnih celic in oploditvijo jajčne celice ter odnos med razmnoževanjem kumulusnih celic in kakovost zarodka in razmnoževanjem kumulusnih celic in zanositvijo smo ovrednotili z Yatesovo korekcijo testa hi-kvadrat.
Raziskavo je odobrila komisija za medicinsko etiko pri Ministrstvu za zdravstvo Republike Slovenije.

Rezultati

Kumulusne celice v kulturi so zrcalile različno sposobnost spreminjanja oblike in razmnoževanja. Po enem dnevu kultiviranja smo opazili naslednje morfološke različice: (I.) Pri 87,0% (60/69) pregledanih vzorcev so kumulusne celice iz kroglaste oblike prehajale v zvezdasto. Viskozni medcelični matriks se je razgradil, kumulusna masa se je delno razpršila in celice so se pritrdile na podlago. (II.) Kulture celic so se pritrdile na podlago, vendar so ohranile kroglasto obliko. Takšno stanje smo opazili pri 5,8% (4/69) vzorcev. Kumulusne celice so se delno razpršile po podlagi, delno pa so ostale v obliki manjših in večjih skupkov. (III.) Pri 7,2% (5/69) vzorcev so kumulusne celice ostale v suspenziji, praviloma kot velik kompakten skupek. Za statistično obdelavo smo kumulusne celice na podlagi morfoloških lastnosti, izraženih v kulturi po enem dnevu, razdelili v dve skupini: 1. kulture celic z nespremenjeno, kroglasto obliko; 2. kulture celic z zvezdasto obliko.
Tretji dan kultiviranja smo ovrednotili sposobnost kumulusnih celic za spreminjanje kroglaste oblike v zvezdasto, razpršenost kumulusnih celic in razmnoževanje. Na podlagi tega smo opisali dva vzorca razmnoževanja: pri 65,2% (45/69) vzorcev so se celice dobro razmnoževale. Kumulusna masa je bila delno ali povsem razpršena, prej kroglaste celice so iztegovale svoje citoplazemske izrastke in tako dobile zvezdasto obliko (vzorec A). Pri nekaterih kulturah iz te skupine so se celice razrastle v povezan enosloj. Pri 34,8% (24/69) vzorcev pa so se kumulusne celice slabo razmnoževale oziroma se sploh niso razmnoževale, kumulusna masa je ostala v obliki enega ali več kompaktnih skupkov. Opaziti je bilo le neznatno spreminjanje kroglaste oblike v zvezdasto ali pa je ostala oblika nespremenjena (vzorec B).
Pri podaljšanju kultiviranja kumulusnih celic na pet dni (pri 53/69 vzorcev) oziroma na 7 dni (pri 29/69 vzorcev) se vzorec razmnoževanja ni spreminjal. Večinoma pa smo opazili naraščajočo luteinizacijo celic, združevanje v skupke in odlepljanje od podlage ter končno degeneracijo celic.
Morfološke spremembe kumulusnih celic in razmnoževanje je prikazano na sliki 1.

A
B
C
D
E

Sl. 1. Svetlobnomikroskopski posnetki morfoloških sprememb kumulusnih celic in razmnoževanja. (a) Morfologija kumulusnih celic, ocenjena po enem dnevu kultiviranja. Kumulusne celice so ostale v suspenziji. Povečava 100-krat. (b) Pritrjanje kumulusnih celic na podlago po enem dnevu kultiviranja brez vidnih morfoloških sprememb. Povečava 150-krat. (c) Morfološke spremembe kumulusnih celic po enem dnevu kultiviranja. Opazno izrazito spreminjanje kroglaste oblike v zvezdasto. Povečava 200-krat. (d) Kumulusne celice po treh dneh kultiviranja z izrazitim spreminjanjem oblike in razmnoževanjem (vzorec A). Celice so se razrastle v povezan enosloj. Povečava 200-krat. (e) Kumulusne celice po treh dneh kultiviranja z neznatnim spreminjanjem oblike in razmnoževanjem ali brez razmnoževanja (vzorec B). Povečava 200-krat.

Morfologijo kumulusnih celic, ocenjeno po enem dnevu kultiviranja, smo primerjali z razmnoževanjem, ocenjenim po treh dneh kultiviranja. Pokazalo se je, da sta pojava značilno povezana (?2 = 6,40, p 0,05). Trajanje menstruacijskega ciklusa pred dajanjem hCG v skupini nenosečih je bilo statistično pomembno krajše (p = 0,002).

Zaključki. Na osnovi ugotavljanja ultrazvočnih značilnosti endometrija, kot so debelina in tip ter gibanje na dan prenosa zarodka v postopku zunajtelesne oploditve v naravnem ciklusu ne moremo predvideti možnosti vgnezditve zarodka.

Uvod

Napredek v ultrazvočni tehnologiji nam je omogočil ocenjevanje tipa endometrija, merjenje njegove debeline in opazovanje subendometrijskega gibanja (1). Pomen ugotavljanja teh značilnosti pri predvidevanju receptivnosti endometrija pa še ni popolnoma pojasnjen. Večina raziskav, ki poskuša razjasniti omenjeno dilemo, ugotavlja povezanost ultrazvočnih značilnosti endometrija z vgnezditvijo zarodkov v postopkih zunajtelesne oploditve (IVF) v spodbujanih ciklusih. Te ugotovitve so si nasprotujoče (1-12).
Po našem mnenju najobjektivneje ugotavljamo dejavnike, ki vplivajo na vgnezditev zarodkov v postopkih IVF v naravnem ciklusu. Raziskav o povezanosti endometrijskih značilnosti z vgnezditvijo zarodkov v naravnem ciklusu je malo. Ugotavljajo le povezanost debeline in tipa endometrija z zanositvijo (13, 14). Večina avtorjev poroča, da iz debeline endometrija ni mogoče predvideti možnost zanositve (5, 8, 15), medtem ko Tomaževič in sod. poročajo o pomembno višji stopnji zanositve pri endometriju, debelejšem od 8 mm (14). Nekoliko večjo napovedno vrednost naj bi po mnenju Coulana s sod. in Uena s sod. imel le tip endometrija (8, 5). Raziskav, ki bi ugotavljale povezanost subendometrijske kontraktilnosti z zanositvijo v naravnem ciklusu IVF, pa v literaturi nismo zasledili.
Tako je bil namen naše raziskave ugotoviti, ali lahko iz ultrazvočno ugotovljenih značilnosti endometrija, kot so debelina, tip endometrija in gibanja subendometrija napovemo možnost vgnezditve zarodka v IVF postopkih v naravnem ciklusu.

Materiali in metode dela

V prospektivno raziskavo smo vključili pare, pri katerih je pri zdravljenju neplodnosti predviden stimuliran postopek IVF. Pogoj za vključitev v postopek v naravnem ciklusu je bila starost žensk manj kot 42 let, vrednosti FSH drugi dan menstruacijskega ciklusa (DMC) 40 13 1 7,69 (1/13)
Skupaj 553 ciklusov 37 zanositev
Total 553 cycles 37 pregnancies

Med zapleti zanositev smo zabeležili dve (5,4%) zunajmaternični zanositvi, 9 (24,3%) zanositev pa se je končalo s spontanim splavom. V enem (2,7%) primeru smo diagnosticirali dvoplodno nosečnost. V preiskovani skupini nismo zabeležili primera ovarijske hiperstimulacije ali adneksitisa.

Razpravljanje

Iz rezultatov je razvidno, da je večina (74,5%) parov opravila le tri cikluse IUI. 70,25% vseh zanositev smo zabeležili v prvih treh ciklusih, kar se ujema s podatki v literaturi. Sahakyan in sod. poročajo, da so 87% vseh zanositev zabeležili v prvih treh ciklusih IUI (5). Tomlinson in sod. opisujejo v retrospektivni analizi 260 ciklusov IUI, spodbujenih s FSH ali s hMG, 22,3-odstotno uspešnost v prvem, 18-odstotno v drugem in 14-odstotno v tretjem ciklusu (9). Plosker in sod. so zabeležili 43 od 48 zanositev v prvih treh ciklusih IUI in tako dokazali statistično večjo možnost zanositve v prvih treh ciklusih ne glede na vzrok neplodnosti (10). Podobno kažejo tudi naši rezultati, saj smo le 29,75% vseh zanositev zabeležili v zadnjih štirih zaporednih ciklusih, ki jih je opravilo le 25,50% vseh parov. Delež zanositve v prvem ciklusu je 6,86%, v drugem 4,63% in v tretjem 5%. Uspešnost 4., 5., 6. in 7. ciklusa je večja v primerjavi s prvimi tremi ciklusi, a je potrebno upoštevati, da so le-ti manj številčni.
Analiza uspešnosti IUI glede na vzrok neplodnosti je pokazala najnižjo uspešnost IUI pri parih z moškim in ženskim vzrokom neplodnosti hkrati, kjer nismo zabeležili zanositve, in pri parih z vzrokom neplodnosti v jajcevodih, kjer je uspešnost znašala le 2,35%. Podobno kažejo tudi raziskave drugih avtorjev. Plosker in sod. so v retrospektivni analizi 381 ciklusov IUI, spodbujenih s klomifen citratom ali z gonadotropini, zabeležili najnižjo uspešnost pri parih z vzrokom neplodnosti v jajcevodih (10%), z več vzroki neplodnosti (10%) in pri endometriozi (9%). Uspešnost IUI je bila pri parih z ovulacijskimi motnjami (30%) celo statistično značilno višja kot pri parih z vzrokom neplodnosti v jajcevodih, endometriozo ali več vzroki neplodnosti (10). Kahn in sod. so ob spodbujanju ovulacije s klomifen citratom in humanim menopavznim gonadotropinom (hMG) opisali le 2,9-odstotno uspešnost IUI pri parih z vzrokom neplodnosti v jajcevodih, kar je bistveno nižje od uspešnosti IUI pri parih z nepojasnjenim vzrokom neplodnosti, ki je znašala 26,9% (11). Sahakyan in sod. poročajo o 11-odstotni celokupni uspešnosti IUI ob spodbujanju ovulacije s hMG ali FSH. V skupini parov z vzrokom neplodnosti v jajcevodih je znašala uspešnost 9%, pri parih z moškim vzrokom neplodnosti pa 7%. Iz analize krivulje o kumulativni stopnji zanositve glede na različne indikacije sklepajo, da je pare z vzrokom neplodnosti v jajcevodih in z moškim vzrokom neplodnosti potrebno prej preusmeriti v postopek IVF, saj so zanositev zabeležili le v okviru prvih dveh ciklusov (5).
Razlika deležev zanositev na ciklus v posameznih starostnih skupinah v naši raziskavi ni bila statistično značilna, vendar je bilo le 13 žensk starejših od 40 let, od teh je zanosila le ena. Čerkez-Habekova in sod. menijo, da starost žensk ne vpliva na uspešnost IUI (1). Tomlinson in sod. so ugotovili, da se uspešnost IUI zmanjša le pri ženskah, starejših od 40 let, in da starost bolnic ne vpliva bistveno na uspešnost IUI (9). Mathieu in sod. so v raziskavi 901 ciklusov IUI z univariatno in multivariatno analizo ugotovili, da je starost partnerja najznačilnejši dejavnik, ki prispeva k zmanjšani možnosti za zanositev. Sklepajo tudi, da imajo bolnice, mlajše od 30 let, v primerjavi z bolnicami, starejšimi od 35 let, večjo možnost za zanositev, vendar razlike niso bile statistično značilne (12). Frederick in sod. so opravili 210 ciklusov IUI pri bolnicah, starejših od 40 let. Delež zanositev na ciklus je bil le 5%, za razliko od 10% zabeleženih pri bolnicah, mlajših od 39 let (13). Podobnega mnenja je tudi Brzechffa in sod., ki so ugotovili značilen padec kumulativne stopnje zanositev po treh ciklusih z naraščanjem bolničine starosti (14).
V vseh 553 ciklusih IUI smo rast foliklov spodbujali s klomifen citratom. Iz podatkov v literaturi je razvidno, da so ciklusi IUI, spodbujeni s klomifen citratom, bistveno manj uspešni kakor ciklusi, ki jih spodbujamo z gonadotropini. Uspešnost ciklusov IUI, ki jih spodbujamo z gonadotropini, pa je teže oceniti zaradi dejstva, da mnogi centri ne opravijo IUI, če se med spodbujanjem ovulacije razvijejo več kot trije ali štirje folikli, zato bolnice preusmerijo v postopek IVF, da bi se izognili večplodni nosečnosti (7, 9, 15). Dickey in sod. so primerjali 524 ciklusov, spodbujenih s klomifen citratom, in 136 ciklusov, spodbujenih s klomifen citratom in/ali hMG v odsotnosti endometrioze in vzroka neplodnosti v jajcevodih. Uspešnost ciklusov, spodbujanih s klomifen citratom in/ali hMG, je bila 22%, uspešnost ciklusov, spodbujanih samo s klomifen citratom, pa le 11% (16). Sadek in sod. so primerjali uspešnost IUI in spermalno perfuzijo jajcevodov ob spodbujanju ovulacije s klomifen citratom ali s klomifen citratom in hMG. Delež zanositev na ciklus je bil pri obeh oblikah inseminacije nižji pri uporabi zgolj klomifen citrata in je znašal 11,6%, ob spodbujanju s klomifen citratom in hMG pa je bil 21,1%, čeprav razlika ni bila statistično značilna (17).
Celokupen delež zanositve na ciklus IUI v naši raziskavi je bil 6,7%. Sklepamo, da je nizka uspešnost posledica spodbujanja ovulacije zgolj s klomifen citratom.
Če primerjamo naše rezultate z rezultati Dickeya in sod., vidimo, da je uspešnost njihovih ciklusov IUI pri spodbujanju ovulacije samo s klomifen citratom 11%, kar je bolje od naših rezultatov. Če pa upoštevamo njihovo izbiro bolnic (izključitev bolnic z endometriozo ali vzrokom neplodnosti v jajcevodih) ter da so tretjino IUI opravili z donorskim semenom, tretjino pri subnormalnem in tretjino pri normalnem spermiogramu, menimo, da so rezultati primerljivi. Čeprav nimamo skupine bolnic, ki bi bila primerljiva z Dickeyevo, smo v skupini, kjer je bil edini vzrok neplodnosti blaga okvara spermiograma, zabeležili 12,12-odstotno uspešnost. Če primerjamo protokola za spodbujanje in indukcijo ovulacije, ne opazimo večjih razlik, razen višje doze hCG, ki znaša 10.000 IE. Vendar je težko govoriti o vplivu tega dejavnika na uspešnost IUI, saj avtorji mnogih študij z visokim deležem zanositev na ciklus IUI uporabljajo za indukcijo ovulacije 5000 IE hCG (1, 8-10).
V istem obdobju je bil delež zanositev na začetni ciklus v postopku IVF ali ICSI v našem centru 26,7% do 36,2% (18). Če primerjamo uspešnost IUI z metodo IVF/ICSI, lahko ugotovimo, da se ob odločitvi za IUI odločamo tudi za dolgotrajnejše zdravljenje, preden dosežemo enako kumulativno stopnjo zanositve kot ob prvem postopku IVF/ICSI. To je potrebno upoštevati še posebej pri starejših bolnicah.
Analiza zapletov kaže, da se je 24,3% zanositev končalo s spontanim splavom, dve (5,4%) zanositvi sta bili zunajmaternični in le v enem (2,7%) primeru smo zabeležili dvoplodno nosečnost. V preiskovani skupini ni bilo primera ovarijske hiperstimulacije ali adneksitisa. Čerkez-Habekova in sod. poročajo le o 1,93-odstotnem deležu spontanih splavov in petih primerih sindroma ovarijske hiperstimulacuje (1), Ragni in sod. pa opisujejo dvoplodno nosečnost v 23,5%, en primer triplodne nosečnosti, 17,6% spontanih splavov in 5,9% ektopičnih nosečnosti pri spodbujanju s klomifen citratom in FSH (15). Dickey in sod. poročajo, da je bil delež večplodnih nosečnosti v skupini bolnic, pri katerih so ovulacijo spodbujali s klomifen citratom, bistveno nižji in je znašal le 4%, za razliko od skupin, spodbujenih s hMG, kjer je znašal približno 30% (16). Kahn in sod. menijo, da je prednost spodbujanja ovulacije s klomifen citratom majhna možnost ovarijske hiperstimulacije, stranski učinek pa je negativen vpliv na endometrij ter posledično na vgnezdenje zarodka, ki lahko vodi v spontani splav, k čemer pripomore tudi pomanjkljivo delovanje rumenega telesca zaradi delovanja klomifen citrata (2). Višji odstotek spontanih splavov v naši raziskavi bi lahko pripisali klomifen citratu. Vsekakor pa sta nizek delež večplodnih nosečnosti in odsotnost ovarijske hiperstimulacije pozitivna učinka omenjenega zdravila.

Zaključki

Iz rezultatov je razvidno, da smo večino zanositev zabeležili v prvih treh ciklusih in da je večina parov opravila le tri cikluse IUI. Najvišji delež zanositev na ciklus IUI smo zabeležili pri parih, kjer je bil vzrok neplodnosti izključno blaga oblika okvare spermiograma, najmanj uspešni pa so bili ciklusi, ki smo jih opravili pri parih z moškim in ženskim vzrokom neplodnosti hkrati. V naši skupini nismo uspeli dokazati negativnega vpliva starosti bolnic na uspešnost IUI.
IUI so enostavna metoda AR, primerna za zdravljenje zlasti idiopatske neplodnosti, nekaterih oblik moške neplodnosti in oligo- in anovulacij. V primerjavi s postopkoma IVF in ICSI je IUI neboleča, neinvazivna, predvsem pa po ceni ugodna metoda. Zato ima pomembno mesto v zdravljenju neplodnosti. Če ni kontraindikacij, jo svetujemo tudi za zdravljenje pred vključitvijo v program IVF.

Literatura

1. Čerkez-Habek J, Šimunić V, Habek D. Uspješnost intrauterine inseminacije sjemenom supruga ili sjemenom donora u liječenju bračne neplodnosti. Gynaecol Perinatol 1998; 7: 157-60.
2. Kahn JA. Assisted procreation. The efficiency and efficacy of fallopian tube sperm perfusion (FSP) and in vitro fertilisation (IVF). Norway: University of Trondheim, 1993.
3. Ograjenšek Z. Umetna osemenitev: In: Meden-Vrtovec H et al. Neplodnost. Ljubljana: Cankarjeva založba, 1989: 363-6.
4. Karlstrom PO, Bergh T, Lundkvist O. A prospective randomized trial of artificial insemination versus intercourse in cycles stimulated with human menopausal gonadotropin or clomiphene citrate. Fertil Steril 1993; 59: 554-9.
5. Sahakyan M, Harlow BL, Hornstein MD. Influence of age, diagnosis, and cycle number on pregnancy rates with gonadotropin – induced controlled ovarian hyperstimulation and intrauterine insemination. Fertil Steril 1999; 72: 500-4.
6. Arici A, Byrd W, Bradshaw K, Kutteh WH, Marshburn P, Carr BR. Evaluation of clomiphene citrate and human chorionic gonadotropin treatment: a prospective, randomized, crossover study during intrauterine insemination cycles. Fertil Steril 1994; 61: 314-8.
7. Zikopoulos K, West CP, Thong PW, Kacser EM, Morrison J, Wu FCW. Homologous intrauterine insemination has no advantage over timed natural intercourse when used in combination with ovulation induction for the treatment of unexplained infertility. Hum Reprod 1993; 8: 563-7.
8. Zorn B, Đukanović S, Drobnič S, Virant-Klun I, Kolbezen-Simoniti M, Bokal-Vrtačnik E. Intrauterine insemination: evaluation of the results according to the woman’s age, semen quality and type of ovarian stimulation. Gynaecol Perinatol 1997; 6: 129-32.
9. Tomlinson MJ, Amissah-Arthur JB, Thomson KA, Kasraie JL, Bentick B. Prognostic indicators for intrauterine insemination (IUI): statistical model for IUI success. Hum Reprod 1996; 11: 1892-6.
10. Plosker SM, Jacobson W, Amato P. Predicting and optimizing success in intrauterine insemination programme. Hum Reprod 1994; 9: 2014-20.
11. Kahn JA, Von During V, Sunde A, Sordal T, Molne K. Fallopian tube sperm perfusion: first clinical experience. Hum Reprod 1992; 7: 19-24.
12. Mathieu C, Ecochard R, Bied V. Cumulative conception rate following intrauterine artificial insemination with husband’s spermatozoa: influence of husband’s age. Hum Reprod 1995; 10: 1090-7.
13. Frederick JL, Denker MS, Rojas A, Horta I, Stone SC, Asch RH et al. Is there a Role for ovarian stimulation and intrauterine insemination after age 40? Hum Reprod 1994; 9: 84-6.
14. Brzechffa PR, Daneshmand S, Buyalos RP. Sequential clomiphene citrate and human menopausal gonadotrophin with intrauterine insemination: the effect of patient age on clinical outcome. Hum Reprod 1998; 13: 2110-4.
15. Ragni G, Maggioni P, Guermandi E, Testa A, Baroni E, Colombo M et al. Efficacy of double intrauterine insemination in controlled ovarian hyperstimulation cycles. Fertil Steril 1999; 72: 619-22.
16. Dickey RP, Olar TT, Taylor SN, Curole DN, Rye PH. Sequential clomiphene citrate and human menopausal gonadotrophin for ovulation induction: comparison to clomiphene citrate alone and human menopausal gonadotrophin alone. Hum Reprod 1993; 3: 56-9.
17. El Sadek MM, Amer MK, Abdel-Malak G. Questioning the efficacy of Fallopian tube sperm perfusion. Hum Reprod 1998; 13: 3053-6.
18. Vlaisavljević V, Kovačič B, Gavrić-Lovrec V, Reljič M. Simplification of the clinical phase of IVF and ICSI treatment in programmed cycles. Int J Gynecol Obstet 2000; 47: 1-7.